1．抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术（Avidin Biotin–Peroxidase Complex technique, 简称ABC技术）

（1）基本原理：ABC法是Hsu 等于1981年在HRAB法和LAB法的基础上改良的，其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。与LAB法和BRAB法不同的是第一抗体不为标记物所标记，生物素标记的第二抗体与ABC复合物相连接。复合物是将过氧化酶结合在生物素上、再将生物素—过氧化酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的（图6-1），最后进行显色反应定位。

图6-1　ABC法

（2）操作步骤

①冰冻切片或石蜡切片均可。

②冰冻切片可用丙酮固定10min左右，0.01mol/l PBS (pH 7.2～7.6) 洗5min，更换3次。石蜡切片需经脱蜡，系列酒精至水。

③第一抗体，室温孵育15min。

④PBS洗5min，更换3次。

⑤加生物素标记的第二抗体（1：200左右），孵育15min。

⑥PBS洗5min，更换3次。

⑦加ABC复合物室温作用15min 。

⑧PBS洗5min，更换3次。

⑨用DAB—H2O2液（配法见附录）显色。

⑩复染。

⑾封片、观察。

ABC复合物的配制：经试验，生物素与抗生物素之比为1：4时，能获得最佳满意效果。即抗生物素10μg/ml加2.5μg/ml生物素，应用0.05mol/l Tris—HCl液，pH7.6，在应用前30min配制。

（3）ABC法的评价及实验注意事项

ABC法具有：①敏感性强：Hsu等应用ABC法与PAP法相比发现敏感性较PAP法高20～40倍能显示PAP法所不能显示的抗原。这是因为生物素与抗生物素间有较强的结合力，一个抗生物素分子具有可与生物素结合的4个活性部位，其中一部分可与生物素标记的过氧化物酶相结合，另一部分可与生物素标记的免疫球蛋白结合。生物素通过氨基与抗体或过氧化物酶分子相结合，一个过氧化物酶或免疫球蛋白分子可以结合多个生物素分子，从而增加了免疫球蛋白或过氧化物酶结合抗生物素的能力。在ABC反应中，抗生物素作为桥连接于生物素标记的酶和生物素标记的抗体之间，而生物素标记的过氧化物酶分子又可作为桥连接于抗生物素分子之间，于是形成了一个含有3个以上过氧化物酶分子（大于PAP复合物）的网格状复合物，敏感性极大提高。②特异性强，背景染色淡：由于敏感性高，第一抗体和第二抗体都可被稀释至尽可能的高度，减少了非特异性染色。③方法简便，节　约时间：由于ABC法敏感，操作的抗原抗体反应的时间可由PAP法所需的数天缩短为2h左右，各层抗体作用仅需15min。④国内上海生物制品所等单位制备的生物素—抗生物素染色药盒经质量鉴定符合标准，已提供国内市场。⑤由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。

实验注意事项：

①内源性生物素活性及其消除：生物素是一种辅酶，是在脱羧基酶、羧基转换酶等催化的代谢环节　中所产生的羧基的中间载体，它存在于某些组织和细胞内，在应用ABC染色时会与抗生物素结合而产生非特异性染色。因此，对抗生物素结合性较高的组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺，在应用ABC方法前应预先以0.01%的抗生物素和0.01%的生物素溶液分别作用20min左右，以消除内源性抗生物素结合活性，每次作用后用PBS洗5min，更换3次。Nar－itoku和Taylor（1982）报告神经组织中的乳糖可与抗生物素结合产生假阳性反应，以2—甲基-O-甘露糖预孵育切片可封闭神经组织内乳糖分子上的结合点，从而阻止与抗生物素蛋白的结合。必要时，也可用0.3%H2O2—100%甲醇孵育以消除内源性过氧化 物酶活性。

②生物素制剂之间相互亲合性差异大，因此在应用ABC试剂时，应注意厂家和批号，对购进试剂应进行事先测试，以保证实验结果的稳定性。

③ABC试剂保存温度以4℃为佳，据报告保存可达两年之久，仍能获得满意效果，而在—20℃生物活性在短期内即被破坏。