三、再生式序列复制技术

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这一反应依赖于AMV逆转录酶、RnaseH和T7RNA多聚酶的共同作用。当逆转录酶合成cDNA第一链后,RnaseH降解模板RNA,逆转录酶合成cDNA第二链,T7RNA多聚酶以此cDNA为模板,转录出与样本RNA序列相同的RNA。其RNA扩增过程与TAS相同。由于所使用的工具酶工作的适宜温度是37℃,所以只要在第一步变性、复性后,整个反应过程不再需要温度循环。具体方法如下:制备引物A、B,引物A有TRNA多聚酶识别、结合位点。将引物、样本加入扩增缓冲液中,65℃,1min,降温至37℃,加入人工具酶,37℃保温1h,冰浴中止反应。可用葡聚糖夹心法检测扩增产物。

这一方法有几点值得注意:(1)反应是在37℃恒温中进行的;(2)产物中有RNA,反义RNA的cDNA,RNA的拷贝数高于Cdna(90:1);(3)效率高于PCR。使拷贝数扩增到105,PCR要85min,3SR仅要15min;(4)逆转录酶也具有RnaseH活性,反应又是在37℃中进行,因此推测某些病毒,如HIV-1感染的细胞内可能存在类似3SR的病毒基因扩增机制。

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