三、冷冻蚀刻免疫电镜技术

冷冻蚀刻法（Freeze Ftching），也称冷冻复型法（Freeze Replica）或冷冻切断（Freeze Fracture），是研究生物膜结构的重要方法之一。其主要步骤首先是将样品在液氮中冷冻，然后放到真空喷镀仪中切断，切断后的切面上有细胞器，其间还有冻成洋的水分。再加热使冰升华，将水份蒸发，把细胞器的膜结构暴露出来，这一步骤就称为冷冻蚀刻。如不进行蚀刻就称为冷冻切断。向暴露的膜结构上喷镀铂—碳投影，再喷碳来加固。这样就在切断的样品表面形成一层复型膜。在此复型膜上印下了细胞切面的立体结构。从真空中取出样品，把复型膜下面的组织腐蚀掉，再把复型膜捞在铜网上，在透射电镜下观察复型膜。

关于生物膜的分子结构，目前被大家公认的并为冷冻复型电镜观察所证实的是流动镶嵌型（图7-1），即脂质—球状蛋白质镶嵌模型。依照这上模型学说表明，生物膜是一种流动

图7-1　生物膜分子的流动镶嵌模型及冷冻断裂面图解

的、可塑的、镶嵌蛋白质分子的脂质双分子层的膜；脂质双分子层中每一分子分别具有两极，一端为亲水极，朝向膜的内、外表面，而另一端的疏水极朝向膜的中线部位，两排分子彼此相对，构成生物膜膜性结构的基础。蛋白质分子彼此相对有嵌入性和表在性两种，前者大约占蛋白质总量的3/4左右，外形近似球状，镶嵌在脂质分子层的不同深度内，而后者则大多附着于细胞膜的胞质面。在冷冻劈裂后，生物膜的水平断面大多发生在单位膜的疏水极。因此，膜的亲水部，分别命名为PS（与细胞质，核质或线粒体内基质相邻的面）和ES（与细胞外间隙或细胞内间隙或细胞内间隙相邻的面，如内质网腔、核质间隙、线粒体内、外膜之间的腔和其它各种泡的腔等）。膜的疏水部、亦即劈裂面分别叫做EF（面向细胞质、核质、或线粒体基质的面）和PF（向细胞外间隙或内间隙的面）。从70年代初期开始，冷冻蚀刻免疫电镜技术已开始在应用，但由于免疫标记必须在冷冻蚀刻步骤以前进行，所以仅能标记细胞外表面（ES）。80年代开始建立了断裂—标记细胞化学方法，将细胞膜劈开后，中央的两侧断面（EF与PF）以及各种细胞器的膜的各个表面及细胞质与核质都能被标记，为此技术的广泛应用创造了条件。应用此法还可对抗原与受体分子进行定量统计。