十、梅毒螺旋体的检查法

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免疫荧光细胞化学应用于梅毒血清学诊断有很多文献报道。70年代应用PAP法又将敏感性提高了许多倍,此法已作为梅毒诊断的常规方法。用间接免疫荧光法可PAP法,取已知梅毒螺旋体作抗原,检查病人血清中的特异性抗体。

(一)抗原制备

以标准株(如Nicol株)梅毒螺旋体感染家兔睾丸,约1周后待睾丸产生明显炎症,剖腹将睾丸摘除,仔细清除精索、附睾和包膜,然后以灭菌器械将其剪成薄片,置于烧瓶内,加入20ml生理盐水,振荡30min,使螺旋体逸出,2000r/min离心10min以除去组织碎块和血细胞,将上清高速离心(10,000r/min)30min,去上清,沉淀以5ml生理盐水洗涤,再高速离心,洗涤,反复3次以上,以尽可能除去组织成分和家兔球蛋白,最后以pH7.2PBS(内含0.01%硫柳汞或数滴福尔马林以防腐)将沉淀制成敏感毫升约含10,000,000螺旋体的悬液,置4℃保存备用。有效期约半年。

(二)荧光抗体

用抗人IgG和IgM荧光抗体。为诊断新生儿先天性梅毒,必须用抗人IgM荧光抗体。

所有稀释用PBS 0.1mol/L Na2HPO4-KH2PO4,0.15mol/lNaCl Ph7.2含1%Tween-80。

(三)间接免疫荧光染色方法(FIA试验)

1.定性检查先将待检血清灭活。在载玻片上以白金耳取抗原液涂片,每片涂4个点,在室温中晾干,丙酮固定10min。各点分别加-1:50稀释待检血清;②-1:200稀释阳性血清;③-1:50稀释阴性血清;④-PBS。放入湿盒,在37或室温中放置20min,用PBS振荡洗涤10min,再加适当稀释的抗人IgG和IgM荧光抗体,再同上条件下放置20min,水洗,封裱,镜检。结果如①、②荧光阳性,③、④阴性,待检血清即判断为阳性。阳性时梅毒螺旋体呈明亮的黄绿色荧光,亦有人将待检血清稀释1:200作定性检查,这样可排除低稀释时正常人可出现的假阳性反应,此法又称FTA-200试验。

2.滴度测定如定性检查阳性,则被检血清应进一步稀释成1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600……以定出染色滴度,滴度疑点以螺旋体发“++”荧光为标准。

(四)荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验(Fluorescent treponemal antibody – absorption Test 简称FTA-ABS)

FTA-200试验敏感性较差,有时查不出潜伏期和晚期梅毒。FTA-ABC试验不但敏感性高,而且特异性更好。方法是将非致病性螺旋体Reiter株的培养液于121℃高压加热10min,然后高速离心、沉淀,取其上清浸液作为吸附剂,并用以稀释病人血清(1:5),然后如上法(FTA试验)进行染色检查。

FTA-ABC所用的反复洗涤过的纯梅毒螺旋体抗原,推荐置1.0%清蛋白、0.0375mol/l葡萄糖、0.01mol/L二氯化镁和0.85%氯化钠溶液(用0.1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.8配制)中冰冻干燥保存,其中清蛋白起保护剂的作用,葡萄糖可增加折光率,二氯化镁维持螺旋体的形态学,缓冲液稳定pH。

(五)梅毒螺旋体的直接检查法

取梅毒局部硬结渗出液涂片,用直接法或间接法免疫细胞化学染色,更容易发现隐藏在细胞碎片之间的螺旋体。免疫荧光检出效果和暗视野检一样敏感。如用RB200标记牛清蛋白作初染色,图像更为清晰。

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