六、生物素随机引物标记探针方法
以HBV DNA为例。取HBv DNA质粒0.5μg,随机引物(Pharmacia)2μg,用TE(pH8.0)补足体积至10μl;100℃,热变性5min,骤冷10min。加10×缓冲液(500mmol/l Tris –HCl (Ph6.6),100mmol/L MgCl2,10mmol/L β巯基乙醇),BSa 500μg/ml 5μl,5mmol/l dATP/dGTP dCTP各1μl,按不同比例加入Bio –11-Dutp,和dTTP,用三蒸水补足体积至48μl,加DNA聚合酶(SABC)8u,混匀,37℃,2h,加0.5mol/l EDTA(Ph8.0)2μl,终止反应。
在随机引物标记体系中,加入不同梯度浓度比值的Bio-11-dUTP/dTTP(%),发现二者比值明显影响探针标记率和显色灵敏度。Bio-11-Dutp/dTTP(%)比值为35%时,其标记率最高,显色灵敏度达0.2pg,杂交灵敏度为1~2pg。二步法缺口平移标记HBv DNA探针,其灵敏度低于随机引物标记。Mackeg等(Focus,1992;14:21)证实了用随机引物标记探针具有放大的效应。随机引物中加入一定比例的dTTP,能增加HBv DNA探针的标记率和灵敏度。其灵敏度接近同位素标记探针的灵敏度。
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