一、凝集素电镜标记技术

凝集素的特性及标记原理详见第五章　，近年来，凝集素电镜标记技术应用日益广泛，且获得较为满意的效果。凝集素电镜标记技术方法较多，常用的有凝集素—酶（常用为HRP）、凝集素—生物素—酶电镜标记技术。现将凝集素—酶电镜标记技术（包埋前染色）简介如下（Sterit 和Kreatzberg,1987）。

（1）固定：常用为PLP或多聚甲醛—戊二醛固定液。如为取脑组织，可将已藻注动物在4^℃过夜，次日取脑组织置0.1mol/L磷酸或二甲胂酸钠缓冲液（含7.5%蔗糖）中漂洗。

（2）振动切片机（Vibratome）切60μm的厚片。

（3）切片孵育在PBS（内含0.1mol/l CaCl₂_、Mgcl₂和MnCl₂）10min（有作者主张此步可省略）。

（4）为增强细胞通透性，切片可孵育于含0.1%胰蛋白酶和0.1CaCl₂水溶液中，pH7.8,37^℃孵育30min。

（5）PBS洗3次，每次2min。

（6）凝集素—HRp 1：10 在PBS中（含0.1%Triton X--100）4℃过夜，最好不断轻轻振荡。

（7）PBS洗3次，每次2min。

（8）DAB-H₂O₂显色。

（9）1%O_SO₄水溶液固定。

（10）系列酒精脱水，EPON包埋，切片。

（11）电镜沿—铀双染观察。

凝集素呈高电子密度常沉积在细胞膜上，易与电子染色相区别。