二、应用生物素标记DNA探针电镜原位杂交技术
(一)基本原理
应用DNA探针缺口翻译(nick translation)方法,通过碱基配对以一条DNA链为模板,将生物素标记的某一种脱氧三磷酸核苷酸如Bio-dUTP渗入有缺口的DNA链。将生物素标记的DNA探针与细胞或组织进行原位杂交。显示方法有二种:一种是用HRP显示,类似免疫电镜技术中采取的包埋前染色法,利用地高辛-过氧化物酶HRP显色法进行光镜水平的厚片原位杂交免疫细胞化学染色,其步骤与第二十章 叙述的原位杂交免疫细胞化学基本方法相同,只是为了减少细胞微细结构的损伤,在包埋过程中减少H2O2和Triton X-10等易损伤细胞与组织结构的试剂用量(向正华等1993)。在显色完毕后,取反应阳性部位按常规电镜操作程序进行锇酸后固定,脱水,包埋,切片和观察。此法利用HRP免疫反应产物具有极高电子反应密度体积大小不一,加之非特异性反应产物常掩盖微细结构的背景,不易达到准确的定位。现在比较广泛应用的是生物素-蛋白A(PA)胶体金(gold)标记技术。用于原位杂交的电镜定位,取得较为满意的效果。其基本原理是利用生物素标记探针与细胞或组织进行原位杂交后,利用抗生物素抗体-结合蛋白A-金标记杂交体的超微结构定位,类似免疫电镜中的包埋后染色。在包埋剂应用方面,有报告应用环氧树脂包埋获得成功的。但大多数较满意的结果均获自低温亲水性包埋剂——Lowicryl-K4M,也有应用LR-white作为包埋剂的(详见第七章 )。
(二)应用生物素标记DNA探针-PA-gold电镜杂交技术(Binder et al,1986)
1.固定现认为应用4%多聚甲醛加0.1%戊二醛在磷酸缓冲液中(pH7.4),为较理想的固定剂,也有主张单纯用4%多聚甲醛的,因经实验证明如应用高浓度4%的戊二醛比用多聚甲醛样品其杂交率减低60%。但作者认为应用少量戊二醛可较好的保持细胞的微细结构。也有报告用酒精/醋酸混合液的。多聚甲醛-戊二醛固定时间在15min至1h。然后放入Ringer氏液或PBS,在4℃含7%蔗糖的0.15mol/L磷酸缓冲液中储存过夜。
2.脱水次日,用0.15mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)冲洗30min,然后进行脱水,①65%乙二醇,0℃,60min;②80%乙醇-35℃,120min;③100%K4M:80%乙醇 =1:1,-35℃,120min;④100%K4M:80%乙醇=2:1,-35℃,60min;⑤100%K4M -35℃,过夜。
3.包埋 按照Roth et al(1981),组织块包埋于盛有K4M的胶囊中,在-35℃紫外线灯(波长360nm)照射聚合24~48h。取出后置室温,用紫外线灯继续照射24h,使变硬易于进行超薄切片。胶囊短期可保存于室温,如需长期保存,宜置于-70℃冰箱中,可保存近1年。
K4M配制(中等硬度)
交联接剂(cross-linker)2.7mg
单体(monomer)17.3mg
引发剂(initiator)0.10mg
可根据硬度需要调整各化合物比例。增加交联剂的量,组织块的硬度增加。
4.切片超薄切片50~60nm,捞于有覆有Formavar和碳膜的镍网上。
5.组织前处理和预杂交用含0.2mol/l Tris缓冲液的0.1mol/L甘氨酸(Ph7.4)冲洗15min,以除去醛类固定剂对杂交和检测的影响,然后2×SSC冲洗15min,再用变性液(70%去离子甲酰胺,2×SSC)在65℃处理样品5~10min,以达到变性的目的。变化后的样品在预杂交液中(50%去离子甲酰胺,0.5mol/l NaCl, 10mmol/L Tris,1mmol/LEDTA,pH7.5)37℃预处理15min。
6.杂交镍网载有切片面覆盖于杂交液滴(约20μl)上,置于湿盒内37℃,1~2h。杂交液成份与光镜原位杂交免疫细胞化学相同(详见第二十章 ),如为DNA探针须在沸水中先煮2~3min,以使之变性,然后迅速移至冰浴。
整个杂交过程须注意防止镍网上的杂交液干掉。
7.杂交后漂洗
含50%甲酰胺的2×SSC液37℃30min
含50%甲酰胺的1×SSC液室温30min
无甲酰胺的1×SSC液室温20min
样品置1×SSc 4℃过夜
0.01mol/LPBS(pH7.2) 室温10min
4%BSA 封闭 15min
8.羊抗生物素IgG抗体(sigma)1:100(稀释用PBS液:2%NaCl, 0.05% KCl, 0.05% KH2PO4,0.278% Na2HPO4,另加300mmol/L NaCl, 0.5% Triton X-100)室温反应2h。
9.含0.1% BSA的PBS液洗3×30min。
10.兔抗羊IgG的IgG相连10nm胶体金(Sigma)1:100(稀释用1%BSA缓冲液:20mmol/l Tris –HCl, pH8.2,0.9% NaCl,0.02mol/L叠氮钠,0.5%Triton X-100),室温反应1h。
11.1%BSA缓冲液3×30min,PBS(pH7.2)15min,蒸馏水洗5min,空气干燥。
12.醋酸双氧铀染色20min,柠檬酸铅染色15min,空气干燥后电镜观察。
应用本法标记有如下优点:(1)可获迅速的信号检测;(2)形态学保存较好;(3)与放射性同位素原位分子电镜杂交技术的信/噪比例相近。是目前公认在电镜水平应用同位素标记原位杂交技术较为理想的方法。胶体金颗粒电子密度高,明显地区别于非特异性染色与污染,能达到较为满意的超微结构定位。本技术的难点在于:①实验周期长;②亲水性低温包埋剂制作切片,由于亲水性强,捞取比较困难,切片易于破裂;③探针的纯度与杂交后彻底的漂洗,这是本实验成功的关系,而彻底的漂洗又易导致镍网切片的破裂,作用推荐应用大量漂洗液或漂洗中设置多个漂洗杯,勤换漂洗液,或用软塑料瓶加笔状喷头,增加水压等方法,但不论漂洗或喷水冲洗都必须注意水流与网面平行而不能垂直,否则更易导致切片的破裂。④杂交时间:Binder等证明杂交1h即可出现特异性,到5h之内不断增加。Lawrence和Singer(1985)实验也表明杂交后3~4h杂交时特异性就可达到最大值,虽然此后杂交仍继续进行,杂交率并不再增加。焦仁杰等(1992)对整装细胞的试验也与上述实验相同,他们发现杂交4h和杂交20h相当,但前者的结构保存要好得多。他们实验表明,切片标本的杂交时间大约需9~10h。因此,选择最短而又最有效的杂交时间对有效地保持形态学结构是十分重要的。Binder认为生物素PA-Gold电镜杂交技术所需理想杂交时间为1~2h。⑤应用含甲酰胺(formamide)的缓冲液漂洗易导致金粒聚集的非特异性背景,因此Binder在实验后建议试用以PBS缓冲液漂洗5×10min代替含甲酰胺的盐液,经证明可避免或减少这种非特异性染色;⑥多数作者发现应用K4M包埋剂在电镜杂交技术是最理想的,其结果可与无包埋剂的培养细胞涂片、染色体铺片等的信/噪比值相等。
虽然生物素-PA-Gold电镜杂交技术在K4M包埋切片获得了较为满意的结果,但Lawarence和singer(1985)在比较了三种检测系统的信/噪(signal/Noise,S/N)得到的结果是32P标记为70、3H标记为20、而生物素标记的S/N值最低,为10。Webster等(1987)同时比较了生物素标记P0-HRP糖蛋白cDNA探针(包埋前染色)和生物素标记P0-糖蛋白cDNA探针-蛋白A-胶体金(包埋后染色)电镜杂交技术,观察15天大鼠三叉神经节 雪旺氏细胞髓鞘的标记,固定剂应用PLA溶液(4%多聚甲,15%(V/V)饱和苦味酸)和0.08%戊二醛(用磷酸缓冲液配),二者均获显示,但作者仍认为应用PA-Gold电镜杂交技术在K4M包埋切片上进行载网杂交的显示结果以及形态保存更为理想。
- 应用生物素标记DNA探针电镜原位杂交技术《实用免疫细胞与核酸》
- 应用某些诊断或治疗手段《预防医学》
- 应用特异单引物法标记DNA探针《实用免疫细胞与核酸》
- 应用良方《焦氏喉科枕秘》
- 应用同位素标记cRNA探针电镜原位杂交技术于染色体制片《实用免疫细胞与核酸》
- 应用和评价《免疫学和免疫学检验》
- 应用相对数时的注意事项《预防医学》
- 应用地高辛标记rRNA探针的电镜原位杂交技术《实用免疫细胞与核酸》
- 应用药性《麻科活人全书》
- 应用ISHH技术对染色体制片、基因分配(Chromosomalassignment of genes)的研究《实用免疫细胞与核酸》
- 应用于受体的研究《实用免疫细胞与核酸》
- 应用《免疫学和免疫学检验》
- 应用直线相关与回归分析时的注意事项《预防医学》
- 应响歌《达摩洗髓易筋经》
- 应用诸方《伤科大成》
- 应详细介绍研究对象的情况《预防医学》
- 应用诸方《医门补要》
- 应下诸证《温疫论》
- 应用注意事项《药理学》
- 应下诸证《医学集成》
- 应章弟三阴疟《孙文垣医案》
- 应突《中医词典》
- 应指《中医词典》
- 应痛丸《三因极一病证方论》
- 应钟《中医词典》
- 应痛内托丸《洪氏集验方》
- 硬脊膜外腔阻滞麻醉《外科学总论》
- 应天者动五岁而右迁应地者静六期而环会《读医随笔》
- 硬睑痴睛《中医词典》
- 应声虫病《奇方类编》
- 硬睑硬睛《中医词典》
《实用免疫细胞与核酸》
- 前言
- 第一章 总论
- 第一节 有关的免疫学理论(缺)
- 第二节 免疫细胞化学的有关技术概述
- 第三节 有关细胞和组织学技术
- 参考文献
- 第二章 抗原和抗体的制备
- 第一节 抗原的制备(缺)
- 第二节 抗体的制备
- 第三节 抗体的提取与纯化(缺)
- 第三章 免疫荧光细胞化学技术
- 第一节 免疫荧光细胞化学的原理
- 第二节 荧光抗体的制备
- 一、荧光素
- (一)异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate, GITC)
- (二)四乙基罗达明(tetraethylrodamineB200, RB200)
- (三)四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethylrhodamineisothiocyanate, TMRITC)
- 二、荧光素标记抗体的方法
- 三、荧光抗体质量控制
- 四、荧光抗体的保存
- 第三节 免疫荧光细胞化学染色方法
- 第四节 荧光显微镜检查法
- 第五节 非特异性染色的消除方法
- 参考文献
- 第四章 免疫酶细胞化学
- 第一节 固定和切片
- 第二节 染色方法
- 第三节 结果分析
- 第四节 ICC的几种特殊应用
- 参考文献
- 第五章 免疫金银及铁标记技术
- 第一节 免疫金技术发展史
- 第二节 溶胶的基本概念
- 第三节 胶体金的制备方法
- 一、制备胶体金的准备
- 二、制备胶体金的方法和步骤
- 第四节 胶体金的质量鉴定
- 第五节 胶体金标记物的制备
- 第六节 免疫胶体金银细胞化学染色的固定剂选择
- 第七节 光镜免疫金银细胞化学方法
- 第八节 免疫胶体铁细胞化学
- 参考文献
- 第六章 亲合组织化学技术及免疫细胞化学技术的某些进展
- 第一节 抗生物素—生物素免疫细胞化学染色法
- 一、基本原理
- 二、几中抗生物素—生物素染色法
- 第二节 葡萄球菌蛋白A(SPA)
- 第三节 凝集素
- 第四节 免疫细胞化学技术的某些新进展
- 参考文献
- 第七章 电子显微镜免疫细胞化学技术
- 第一节 电子显微镜免疫细胞化学技术概述
- 第二节 免疫铁蛋白技术
- 第三节 免疫酶细胞化学技术
- 第四节 免疫电镜胶体金标记法
- 第五节 其它免疫电镜技术
- 参考文献
- 第八章 蛋白质与多肽激素的放射免疫分析
- 第一节 概述
- 第二节 放射性碘标记
- 一、同位素的选择
- 二、蛋白质与多肽激素的放射性碘标记
- 三、放射性标记化合物的纯化与鉴定
- 第三节 结合和游离部分的分离
- 第四节 样品的前处理
- 第五节 放射免疫分析法的建立
- 参考文献
- 第九章 免疫细胞化学与图像分析
- 第十章 流式细胞术(FCM)在免疫细胞化学中的应用
- 第一节 流式细胞术简介
- 第二节 FCM在生物医学工程学方面的应用
- 第三节 FCM对外周白细胞的免疫荧光分析
- 参考文献
- 第十一章 免疫细胞化学在神经科学中的应用
- 一、确定神经递质的性质、定性和分布
- 二、探查和发现新的神经递质
- 三、追踪神经束的行径及其投射区
- 四、区别神经细胞、神经胶质细胞和神经内分泌细胞
- 五、研究神经递质的超威结构定位
- 六、神经递质共存的研究
- 七、个体和种族发育的研究
- 八、与神经组织培养技术相结合进行神经生物科学的研究
- 九、应用于受体的研究
- 十、神经系统的机能研究
- 第十二章 肿瘤免疫细胞化学
- 第一节 神经肿瘤免疫细胞化学
- 第二节 神经内分泌肿瘤免疫细胞化学
- 第三节 软组织与骨肿瘤细胞化学
- 第四节 免疫活性细胞及其肿瘤的免疫细胞学
- 一、免疫活性细胞的免疫细胞化学
- 二、恶性淋巴瘤的免疫细胞化学标记
- 第五节 上皮组织肿瘤免疫细胞化学
- 参考文献
- 第十三章 消化器官免疫细胞化学
- 第一节 胃肠道粘膜免疫细胞化学特点
- 第二节 胃肠道粘膜抗体产生细胞
- 第三节 消化道分泌生IgA
- 第四节 胃肠道粘膜T淋巴细胞
- 第五节 癌胚抗原的免疫细胞化学
- 第六节 胃肠道溶菌酶
- 第七节 消化管壁内神经丛的免疫细胞化学
- 第八节 肝脏疾病免疫细胞化学
- 参考文献
- 第十四章 肾脏疾病免疫细胞化学
- 第一节 免疫细胞化学技术在肾脏疾病中的应用范围
- 第二节 荧光或酶标抗体在肾脏内显示的部位及形式
- 第三节 免疫细胞化学技术在肾脏疾病中应用的意义
- 第四节 各种肾脏疾病的病变以及免疫荧光(酶标)表现特征
- 一、原发性肾小球疾病
- 二、继发于全身性疾患的肾小球疾病
- 三、结缔组织病时的肾脏损害
- 四、血管性疾患导致肾脏的损害
- 五、代谢性疾患引起的肾脏损害
- 六、某些特殊疾病时的肾脏损害
- 七、遗传性和先天性肾病
- 八、杂病
- 九、肾移植
- 十、肾小管间质性疾病
- 参考文献
- 第十五章 自身抗体的免疫组织化学检测方法和应用
- 第一节 自身抗体的免疫组织化学检测方法
- 第二节 在研究和诊断自身免疫性疾病中的应用
- 一、抗核抗体(Antinuclearantibodies, ANA)的检测
- 二、双链DNA抗体(Double strand DNA antibody, dsDNA)的检测方法和应用
- 三、抗核仁抗体的检测法
- 四、抗组蛋白抗体的检测方法
- 五、抗着丝点抗体的检测方法
- 六、抗甲状腺自身抗体(ThyroidAutoantiodies)的检测方法
- 七、平滑肌抗体(Smooth muscle antibody , SMA)的检测
- 八、肝细胞膜抗体(Antibodyto the hepatocyte membrane, HMA)的检测
- 九、线粒体抗体(Mitochondrial antibody, AMA)
- 十、胃壁细胞抗体(Gastricparietal cell antibodies, PCA)的检测
- 十一、胃泌素细胞抗体(GastrinCell antibodies, GCA)的检测
- 十二、胰岛细胞抗体(Isletcell antibady, ICAb)的检测
- 十三、抗肾小球和肺泡基底膜抗体的检测
- 十四、抗皮肤成分自身抗体的检测
- 十五、唾液腺外分泌导管上皮自身抗体的检测
- 十六、抗横纹肌自身抗体的检测
- 十七、肾上腺自身抗体的检测
- 十八、类风湿因子(Rheumatoidfactor)的检测
- 十九、抗中性白细胞胞浆自身抗体(Anti-eutrophilcytoplasmic autoantibody ANCA)
- 二十、增殖细胞核抗原抗体(Proliferativecell nuclear antigen antibody, PCNA)
- 二十一、抗类风湿关节 炎相关核抗原的抗体(Antirheu-matoidarthritis associated nuclear antigen antibody, RANA)
- 二十二、抗精子抗体(Anti-spermantibody, ASA)
- 二十三、其他自身抗体的检测
- 第三节 自身抗体产生的机理
- 参考文献
- 第十六章 病原体的免疫细胞化学快速检查方法和应用
- 第一节 在细菌学中的应用
- 一、甲组溶血性链球菌的快速检查法
- 二、脑膜炎双球菌的快速检查法
- 三、霍乱弧菌和副霍乱弧菌的快速检查法
- 四、鼠疫杆菌的快速检查法
- 五、炭疽杆菌的快速检查法
- 六、致病性大肠杆菌的快速检查法
- 七、结核杆菌的快速诊断方法
- 八、其他细菌的快速检查方法
- 九、钩端螺旋体的检查法
- 十、梅毒螺旋体的检查法
- 第二节 在病毒学中的应用
- 第三节 在寄生虫学中的应用
- 第四节 在真菌学中的应用
- 参考文献
- 第十七章 免疫细胞化学在皮肤病学的应用
- 第一节 角朊细胞
- 第二节 黑素细胞及其肿瘤
- 第三节 Merkel细胞
- 第四节 郎格罕细胞
- 第五节 真皮与表皮交界
- 第六节 免疫细胞化学技术在真皮纤维化性疾病研究中的应用
- 第七节 真皮浸润细胞免疫表达
- 第八节 汗腺及汗腺肿瘤的免疫细胞化学特点
- 参考文献
- 第十八章 核酸分子杂交技术概述
- 第一节 核酸的分子结构
- 第二节 DNA的变性与复性
- 第三节 分子杂交
- 第四节 石蜡包埋组织的DNA提取及其应用
- 参考文献
- 第十九章 核酸(基因)分子探针
- 第一节 概述
- 第二节 核酸(基因)探针目的核酸的制备技术
- 第三节 放射性同位素标记核酸探针
- 第四节 非放射性标记的核酸探针
- 一、生物素标记核酸探针方法
- 二、光敏生物素标记核酸探针
- 三、生物素-补骨脂素(Biotin -psoralen)标记法
- 四、生物素-α-氨基乙酸-N-羟基琥珀标记化学修饰的DNA法
- 五、缺口平移法标记生物素DNA探针(二步法)
- 六、生物素随机引物标记探针方法
- 七、异羟基洋地黄毒甙(Digoxigenin)标记核酸探针
- 八、光敏2,4-二硝基苯(光敏DNP)标记DNA法
- 九、三硝基苯磺酸(TNBS)标记核酸探针
- 十、生物素化的RNA探针标记
- 十一、辣根过氧化物酶标记核酸探针法
- 十二、用聚合酶链反应标记高活性DNA探针
- 第五节 寡核苷酸探针的制备
- 参考文献
- 第二十章 原位杂交组织化学
- 第一节 原位杂交组织化学概述
- 第二节 cRNA探针在原位杂交组织化学(ISHH)中的应用
- 第三节 DNA及寡核苷酸探针在原位杂交组织化学中的应用
- 第四节 原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法
- 第五节 原位杂交免疫细胞化学技术的未来与展望
- 参考文献
- 第二十一章 原位杂交技术在染色体和电镜水平的应用
- 第一节 原位杂交技术在染色体铺片的应用
- 一、有关染色体的基本知识及制片
- 二、应用ISHH技术对染色体制片、基因分配(Chromosomalassignment of genes)的研究
- 三、利用ISHH技术对肿瘤或癌前组织的细胞间期染色体铺片进行研究
- 四、利用性染色体特异性DNA探针的ISHH技术
- 第二节 原位分子杂交技术在电镜水平的应用
- 一、应用同位素标记cRNA探针电镜原位杂交技术于染色体制片(Hutchison et al,1982)
- 二、应用生物素标记DNA探针电镜原位杂交技术
- 三、应用地高辛标记rRNA探针的电镜原位杂交技术
- 四、结语
- 参考文献
- 第二十二章 聚合酶链反应(PCR)技术的发展和应用
- 第一节 概述
- 第二节 PCR技术的原理
- 第三节 PCR操作范例及反应体系的组成
- 第五节 PCR各处应用模式
- 一、兼并引物(DegeneratePrimer)PCR
- 二、套式引物(NestedPrimer)PCR
- 三、复合PCR(Multiplex PCR)
- 四、反向PCR(Inverse PCR或Reverse PCR)
- 五、不对称PCR(Asymmetric PCR)
- 六、标记PCR(LP-PCR)和彩色PCR
- 七、加端PCR
- 八、锚定PCR或固定PCR
- 九、玻片PCR
- 十、反转录PCR方法检测RNA
- 十一、定量PCR
- 第六节 样品处理与注意事项
- 第七节 PCR仪器的发展
- 第八节 PCR临床应用领域及特点
- 第九节 其它链扩增技术及应用范围
- 一、免疫PCR
- 二、转录依赖的扩增系统(Transcription-basedAmplification System , TAS)
- 三、再生式序列复制技术(3SR)
- 四、连接酶链式反应(Ligase ChainReaction,LCR)
- 五、PCR-SSCP分析技术
- 六、结语
- 参考文献
- 第二十三章 DNA重组技术及其在基因诊断中的应用
- 第一节 工具酶
- 一、DNA限制性内切酶
- 二、甲基化酶
- 三、分子克隆化的另一些酶
- 第二节 分子克隆载体
- 第三节 DNA重组实验中常用的技术
- 第四节 遗传病与肿瘤的基因诊断
- 第五节 “DNA指纹”与法医鉴定
- 参考文献
- 附录
- 附录一 免疫细胞化学常用试剂介绍
- 附录二 原位杂交组织化学常用试剂及处理
- 附录三 全血细胞培养染色体技术常用试剂配制
- 附录四 实验室常用技术参数资料
- 本书常用缩写词