【岐黄之术】

二、应用生物素标记DNA探针电镜原位杂交技术

《实用免疫细胞与核酸》书籍目录

(一)基本原理

应用DNA探针缺口翻译(nick translation)方法,通过碱基配对以一条DNA链为模板,将生物素标记的某一种脱氧三磷酸核苷酸如Bio-dUTP渗入有缺口的DNA链。将生物素标记的DNA探针与细胞或组织进行原位杂交。显示方法有二种:一种是用HRP显示,类似免疫电镜技术中采取的包埋前染色法,利用地高辛-过氧化物酶HRP显色法进行光镜水平的厚片原位杂交免疫细胞化学染色,其步骤与第二十章 叙述的原位杂交免疫细胞化学基本方法相同,只是为了减少细胞微细结构的损伤,在包埋过程中减少H2O2和Triton X-10等易损伤细胞与组织结构的试剂用量(向正华等1993)。在显色完毕后,取反应阳性部位按常规电镜操作程序进行锇酸后固定,脱水,包埋,切片和观察。此法利用HRP免疫反应产物具有极高电子反应密度体积大小不一,加之非特异性反应产物常掩盖微细结构的背景,不易达到准确的定位。现在比较广泛应用的是生物素-蛋白A(PA)胶体金(gold)标记技术。用于原位杂交的电镜定位,取得较为满意的效果。其基本原理是利用生物素标记探针与细胞或组织进行原位杂交后,利用抗生物素抗体-结合蛋白A-金标记杂交体的超微结构定位,类似免疫电镜中的包埋后染色。在包埋剂应用方面,有报告应用环氧树脂包埋获得成功的。但大多数较满意的结果均获自低温亲水性包埋剂——Lowicryl-K4M,也有应用LR-white作为包埋剂的(详见第七章 )。

(二)应用生物素标记DNA探针-PA-gold电镜杂交技术(Binder et al,1986)

1.固定现认为应用4%多聚甲醛加0.1%戊二醛在磷酸缓冲液中(pH7.4),为较理想的固定剂,也有主张单纯用4%多聚甲醛的,因经实验证明如应用高浓度4%的戊二醛比用多聚甲醛样品其杂交率减低60%。但作者认为应用少量戊二醛可较好的保持细胞的微细结构。也有报告用酒精/醋酸混合液的。多聚甲醛-戊二醛固定时间在15min至1h。然后放入Ringer氏液或PBS,在4℃含7%蔗糖的0.15mol/L磷酸缓冲液中储存过夜。

2.脱水次日,用0.15mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)冲洗30min,然后进行脱水,①65%乙二醇,0℃,60min;②80%乙醇-35℃,120min;③100%K4M:80%乙醇 =1:1,-35℃,120min;④100%K4M:80%乙醇=2:1,-35℃,60min;⑤100%K4M -35℃,过夜。

3.包埋 按照Roth et al(1981),组织块包埋于盛有K4M的胶囊中,在-35℃紫外线灯(波长360nm)照射聚合24~48h。取出后置室温,用紫外线灯继续照射24h,使变硬易于进行超薄切片。胶囊短期可保存于室温,如需长期保存,宜置于-70℃冰箱中,可保存近1年。

K4M配制(中等硬度)

交联接剂(cross-linker)2.7mg

单体(monomer)17.3mg

引发剂(initiator)0.10mg

可根据硬度需要调整各化合物比例。增加交联剂的量,组织块的硬度增加。

4.切片超薄切片50~60nm,捞于有覆有Formavar和碳膜的镍网上。

5.组织前处理和预杂交用含0.2mol/l Tris缓冲液的0.1mol/L甘氨酸(Ph7.4)冲洗15min,以除去醛类固定剂对杂交和检测的影响,然后2×SSC冲洗15min,再用变性液(70%去离子甲酰胺,2×SSC)在65℃处理样品5~10min,以达到变性的目的。变化后的样品在预杂交液中(50%去离子甲酰胺,0.5mol/l NaCl, 10mmol/L Tris,1mmol/LEDTA,pH7.5)37℃预处理15min。

6.杂交镍网载有切片面覆盖于杂交液滴(约20μl)上,置于湿盒内37℃,1~2h。杂交液成份与光镜原位杂交免疫细胞化学相同(详见第二十章 ),如为DNA探针须在沸水中先煮2~3min,以使之变性,然后迅速移至冰浴。

整个杂交过程须注意防止镍网上的杂交液干掉。

7.杂交后漂洗

含50%甲酰胺的2×SSC液37℃30min

含50%甲酰胺的1×SSC液室温30min

无甲酰胺的1×SSC液室温20min

样品置1×SSc  4℃过夜

0.01mol/LPBS(pH7.2) 室温10min

4%BSA 封闭 15min

8.羊抗生物素IgG抗体(sigma)1:100(稀释用PBS液:2%NaCl, 0.05% KCl, 0.05% KH2PO4,0.278% Na2HPO4,另加300mmol/L NaCl, 0.5% Triton X-100)室温反应2h。

9.含0.1% BSA的PBS液洗3×30min。

10.兔抗羊IgG的IgG相连10nm胶体金(Sigma)1:100(稀释用1%BSA缓冲液:20mmol/l Tris –HCl, pH8.2,0.9% NaCl,0.02mol/L叠氮钠,0.5%Triton X-100),室温反应1h。

11.1%BSA缓冲液3×30min,PBS(pH7.2)15min,蒸馏水洗5min,空气干燥。

12.醋酸双氧铀染色20min,柠檬酸铅染色15min,空气干燥后电镜观察。

应用本法标记有如下优点:(1)可获迅速的信号检测;(2)形态学保存较好;(3)与放射性同位素原位分子电镜杂交技术的信/噪比例相近。是目前公认在电镜水平应用同位素标记原位杂交技术较为理想的方法。胶体金颗粒电子密度高,明显地区别于非特异性染色与污染,能达到较为满意的超微结构定位。本技术的难点在于:①实验周期长;②亲水性低温包埋剂制作切片,由于亲水性强,捞取比较困难,切片易于破裂;③探针的纯度与杂交后彻底的漂洗,这是本实验成功的关系,而彻底的漂洗又易导致镍网切片的破裂,作用推荐应用大量漂洗液或漂洗中设置多个漂洗杯,勤换漂洗液,或用软塑料瓶加笔状喷头,增加水压等方法,但不论漂洗或喷水冲洗都必须注意水流与网面平行而不能垂直,否则更易导致切片的破裂。④杂交时间:Binder等证明杂交1h即可出现特异性,到5h之内不断增加。Lawrence和Singer(1985)实验也表明杂交后3~4h杂交时特异性就可达到最大值,虽然此后杂交仍继续进行,杂交率并不再增加。焦仁杰等(1992)对整装细胞的试验也与上述实验相同,他们发现杂交4h和杂交20h相当,但前者的结构保存要好得多。他们实验表明,切片标本的杂交时间大约需9~10h。因此,选择最短而又最有效的杂交时间对有效地保持形态学结构是十分重要的。Binder认为生物素PA-Gold电镜杂交技术所需理想杂交时间为1~2h。⑤应用含甲酰胺(formamide)的缓冲液漂洗易导致金粒聚集的非特异性背景,因此Binder在实验后建议试用以PBS缓冲液漂洗5×10min代替含甲酰胺的盐液,经证明可避免或减少这种非特异性染色;⑥多数作者发现应用K4M包埋剂在电镜杂交技术是最理想的,其结果可与无包埋剂的培养细胞涂片、染色体铺片等的信/噪比值相等。

虽然生物素-PA-Gold电镜杂交技术在K4M包埋切片获得了较为满意的结果,但Lawarence和singer(1985)在比较了三种检测系统的信/噪(signal/Noise,S/N)得到的结果是32P标记为70、3H标记为20、而生物素标记的S/N值最低,为10。Webster等(1987)同时比较了生物素标记P0-HRP糖蛋白cDNA探针(包埋前染色)和生物素标记P0-糖蛋白cDNA探针-蛋白A-胶体金(包埋后染色)电镜杂交技术,观察15天大鼠三叉神经节 雪旺氏细胞髓鞘的标记,固定剂应用PLA溶液(4%多聚甲,15%(V/V)饱和苦味酸)和0.08%戊二醛(用磷酸缓冲液配),二者均获显示,但作者仍认为应用PA-Gold电镜杂交技术在K4M包埋切片上进行载网杂交的显示结果以及形态保存更为理想。

1000余本中医古籍txt电子书免费下载

下载《实用免疫细胞与核酸》 电子书打不开?

下载所有中医书籍


返回《实用免疫细胞与核酸》书籍目录
  1. 应用生物素标记DNA探针电镜原位杂交技术《实用免疫细胞与核酸》
  2. 应用某些诊断或治疗手段《预防医学》
  3. 应用特异单引物法标记DNA探针《实用免疫细胞与核酸》
  4. 应用良方《焦氏喉科枕秘》
  5. 应用同位素标记cRNA探针电镜原位杂交技术于染色体制片《实用免疫细胞与核酸》
  6. 应用和评价《免疫学和免疫学检验》
  7. 应用相对数时的注意事项《预防医学》
  8. 应用地高辛标记rRNA探针的电镜原位杂交技术《实用免疫细胞与核酸》
  9. 应用药性《麻科活人全书》
  10. 应用ISHH技术对染色体制片、基因分配(Chromosomalassignment of genes)的研究《实用免疫细胞与核酸》
  11. 应用于受体的研究《实用免疫细胞与核酸》
  12. 应用《免疫学和免疫学检验》
  13. 应用直线相关与回归分析时的注意事项《预防医学》
  14. 应响歌《达摩洗髓易筋经》
  15. 应用诸方《伤科大成》
  16. 应详细介绍研究对象的情况《预防医学》
  17. 应用诸方《医门补要》
  18. 应下诸证《温疫论》
  19. 应用注意事项《药理学》
  20. 应下诸证《医学集成》
  21. 应章弟三阴疟《孙文垣医案》
  22. 应突《中医词典》
  23. 应指《中医词典》
  24. 应痛丸《三因极一病证方论》
  25. 应钟《中医词典》
  26. 应痛内托丸《洪氏集验方》
  27. 硬脊膜外腔阻滞麻醉《外科学总论》
  28. 应天者动五岁而右迁应地者静六期而环会《读医随笔》
  29. 硬睑痴睛《中医词典》
  30. 应声虫病《奇方类编》
  31. 硬睑硬睛《中医词典》

《实用免疫细胞与核酸》