二、关于探针的标记

《实用免疫细胞与核酸》书籍目录

(一)cRNA探针的同位素标记

1.标记液(转录标记)

 标记液(转录标记)

2.转录缓冲液

转录缓冲液

※:用地高辛或生物素标记时,用UTP替代。

3.标记终止液

标记终止液

4.标记探针水解液

标记探针水解液

先用dH2O悬浮探针,再加入后两种试剂,轻轻振摇混合,于60℃条件下反应。

5.探针水解时间

探针水解时间

注:LO-探针初始长度(kb)

Lf-探针的终长度(kb)

K-0.11kb/min

6.探针水解终止液

探针水解终止液

每次加入充分混合,临用前配。

7.探针沉淀液

探针沉淀液

每次加入,充分混合,新鲜配制。

(二)寡聚核苷酸3’端标记(cRNA探针)

1.标记反应液

 标记反应液

2.终止液:0.2mol/L EDTA

3.探针沉淀液

探针沉淀液

(三)cRNA探针非同位素标记(地高辛及生物素)

1.标记液

标记液

△:生物素标记时为10mmol/L的生物素-11-UTP

※:为检测标记率而加。

2.转录标记终止液

(1)0.2mol/L EDTA:用于地高辛标记法

(2)生物素标记终止液:

生物素标记终止液:

(四)DNA探针标记常用试剂的配制

(1)10 ×缺口平移缓冲液:200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/Lβ-巯基乙醇、1mg/ml BSA。

(2)缺口平移反应终止液:200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4;11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。

(3)DNaseⅠ:干粉状DNaseⅠ(2000~3000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中(1mg/ml),10μl分装,-20℃保存一年。

(4)10×DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)缓冲液:500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg-Cl2;10mmol/L DTT;0.5mgBSA。

(5)10×激酶缓冲液:500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/LDTT; 1.0mmol/L亚精胺。

(6)10×随机引物标记缓冲液;500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/Lβ-巯基乙醇;500μg/ml BSA。

(7)1×加尾缓冲液:100mmol/L二甲胂化钾,pH7.0,1mmol/l CoCl20.2mmol/L DTT。

(8)1mol/L MgCl2:MgCl247.60g溶于500ml水中,100ml分装,高压灭菌,室温保存。

(9)0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中,调pH至8.0,加水至500ml,100ml分装,高压灭菌,室温保存。

(10)4mol/L醋酸钠:取无水醋酸钠82g溶于200ml水中,用醋酸调pH至6.5,加水至250ml,高压灭菌,或0.45μm膜过滤,室温保存。

(11)10% SDS:10g SDS(十二烷基硫酸钠)溶于50ml水中,加水至100ml,分装后室温保存。

(12)20×SSC:取NaCl 175.3g;柠檬酸钠88.2g;加水至1000ml,用10mol/l NaOH调pH至7.0;高压灭菌,室温保存。

(13)无菌水:100ml去离子水或双蒸水,分装,高压灭菌,室温保存,开瓶后仅限一周使用。

(14)10×激酶缓冲液:500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/lDTT;10mmol/L亚精胺(非必需)。

(15)T4多聚核苷酸激酶:10u/μl,保存在甘油中,-20℃。

(16)TE缓冲液(Tris/EDTA):Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L贮存液),1.0mmol/l ED-TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)贮存液,加水至100ml,室温保存。

(17)2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml,加浓HCl 75ml ,边加边缓慢搅动,至pH7.4,于加水至1000ml。

(18)1mol/L DTT(二硫苏糖醇):3.0g DTT溶于20ml水中,分装,于-20℃贮存。

(19)0.5mol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠盐):在烧杯中先加入300ml水,加入93.5g EDTA-Na2·2H2O,充分混匀,加10mol/l NaOH调pH至8.0,加水至500ml。

(20)10mol/L NaOH:200g NaOH溶于450ml水中,混匀,再加水至500ml。

(21)5mol/L NaCl:292.25g NaCl,加水至1000ml。

(22)1mol/L HCl:加86.2ml浓盐酸至913.8ml水中。

(23)1mol/L CaCl2:147g CaCl2:2H2O,溶于1000ml水中,高压灭菌,室温保存。

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