（二）乳过氧化物酶法

本法反应温和，对抗原、抗体免疫活性影响小，已被广泛应用。缺点是标记率较低，一般为20～40%。

1．原理此法是利用乳过氧化物酶（Lactoperoxidase）有促进微量过氧化氢对¹²⁵I^-的氧化作用，生成¹²⁵I⁺，并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上。

2．方法以标记蛋白质抗原为例。

（1）反应液组成：蛋白质2～5μg溶于磷酸缓冲液10～25μl中，加入Na¹²⁵i 1m Ci(10μl)、乳过氧化物酶溶液25ng(10μl)、H₂O₂200ng(10μl)；

（2）在室温保温7min；

（3）加入H₂O₂200ng(10μl)；

（4）过7min再加入H₂O₂(3μl)；

（5）保温7min后，加入0.5ml、10mmol/L巯基乙醇以停止反应；

（6）10min后加入NaI载体溶液1ml ；

（7）按常规方法分离纯化。

3．注意事项

（1）LPO质量好坏，可直接影响标记率，LPO应在使用前新鲜配制，以防酶活性降低。

（2）LPO用量应小于总蛋白质用量的1%，以减少酶自身碘化而带入的放化杂质。

（3）碘化反应速率分析表明，酶的催化速度很快。

（4）碘化反应在pH4.0～8.5较宽范围内均可进行，最适pH值应依据蛋白质本身性质而定。

（5）H₂O₂应保持低浓度，如高于0.1mmol/L，对酶的活性将有抑制作用。