2.断裂—标记免疫电镜技术
此法是先进行冷冻断裂,再做免疫标记,从而可以对断裂开的各种膜结构及胞浆断面进行标记。
(1)临界点干燥法
①固定:1.0%~2.5%戊二醛PBS液4℃1~2h,PBS冲洗3min×3。
如为细胞悬液,可加入30%BSA后加入1%戊二醛,使BSA凝胶化,将凝胶切成2mm左右的小块,用30%的甘油—PBS浸透后置于用液氮冷却的Freon中冷却。
②冷冻断裂,将冰冻的凝胶小块放在盛有液氮的培养皿中,培养皿放置于二氧化碳—液氮槽中,用预冷的解剖刀切割凝胶小块进行冷冻断裂。
③解冻,置碎块于30%甘油—1%戊二醛磷酸缓冲液中解冻。
④置换甘油,放入1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油,PBS冲洗,3min×2。
⑤免疫标记。
⑥1%锇酸,室温固定30min。
⑦系列梯度乙醇脱水,临界点干燥,喷镀铂—碳膜,次氯酸钠清洗复型,蒸馏水洗,捞于有Formvar 膜铜网上透射电镜观察。
(2)超薄切片法
步骤:①至⑤同临界点干燥法。
⑥1%锇酸,室温固定2h,系列酒精或丙酮脱水,常规电镜包埋。
⑦切半薄片,光镜定位合适的断裂部位,再切超薄切片,铀铅染色,透射电镜观察。
断裂标记法目前文献报告应用较多的是植物凝集素—胶体金免疫标记技术,常用的如刀豆球蛋白(Con A)-- 胶体金免疫标记技术,如第六章 所述,Con A 能与细胞膜中的甘露糖结合,能标记内质网膜、核被膜以及细胞膜的EF面,有助于糖蛋白在超微结构水平的定位。
为保证实验结果的准确性,每组实验在免疫标记阶段应设立对照组。对照组的设计同第一章 总论中的免疫对照染色。
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