三、胶体金双标记技术（常用为蛋白A—胶体金）

1．单面法以不同直径的金粒分别标记两种不同的抗体，以间接法先染第一种抗体，洗净后再染第二抗体。

2．双面法以不同直径的金粒标记的抗体于镍网的两面分另进行免疫染色。本法的优点是可防止两种金标记的抗体的相互干扰，又可防止第一次应用的一抗与其相应的抗原相结合，占据了空间，第二次应用的抗体没有适合的空间使之与相应的抗原相结合。

3．异种动物抗原—抗体染色法如一抗分别用人与兔抗血清，人抗组织抗原A，兔抗组织抗原B。第二抗体分别以不同直径金粒标记的抗人和兔免疫球蛋白。由于种属不同，两种抗血清不会互相干扰，在应用一抗和二抗时都可将两种血清一次混合使用，将四步减少为两步。

4．金标记抗原检查法（Gold—labelled antigen detection method, GLAD 法）此法是Larson（1977）年首先提出的，应用放射性同位素如¹²⁵I或酶标记抗原进行染色。先用特异性抗体与组织抗原反应，标记的纯抗原又与特异性抗体反应。Larson（1980，1981）又在此基础上提出应用胶体金在电镜水平进行双抗原甚至多抗原定位。GLAD原理是：双价的Ig抗体分子过量地加到有抗原的组织切片上，使分子的两个抗原结合点中有一个结合到组织抗原上，而另一端可与标记金的抗原起反应。双标记时，预先将两种不同的抗原标以不同直径的金粒，可分别与相应的第一抗体相结合，从而显示出两种抗原在组织切片的定位。此法的优点是标记物所显示出的组织抗原的部位经过两次选择，标记了抗原只能与相应的特异性抗体相结合而不能与切片中非特异性Ig相结合，因此具有较高的特异性。但由于使用此法时需备有与欲检抗原相同的纯抗原，并要对不同抗原分别进行标记，非一般实验室所能做到，所以至今尚未被广泛应用。

双面金标记法操作程序（Cai et al 1993, 改良自Bendayan et al 1982）.

（1）镍网面A（树脂包埋）

①蒸馏水冲10min。

②10% H₂O₂蚀刻10min室温

③10%正常血清（以0.5mol/l Tris缓冲液pH7.4、含1%BSA和2%Tween20 稀释，简称TBT缓冲液）室温30min。

④以滤纸吸去多余液体，覆于特异性第一抗体1：500（Tris 缓冲液，pH7.4,含1%BSA和0.1%叠氮钠）4^℃，孵育过夜

⑤彻底清洗，应用0.5mol/L Tris缓冲液pH7.2,不含BSA

⑥继之用0.5mol/L Tris缓冲液pH7.6,含1%BSA冲洗

⑦0.5mol/L Tris缓冲液pH8.2,含1%BSA，室温孵15min

⑧羊抗兔IgG标记以15nm金粒，应用0.5mol/l Tris缓冲液pH8.2、含1%BSA稀释1：40，孵育2h，室温

⑨0.5mol/L Tris缓冲液pH7.4 冲洗

⑩蒸馏水冲洗

（2）镍网面B，重复①～⑩，只在第④时更改另一特异性一抗，在⑧时羊抗兔IgG标记以5nm金粒。

（3）铀铅双重染色，电镜观察，可见二种不同直径金粒标记。

注意事项：①所有溶液均须经加有微孔滤纸（0.45μm孔，国内外现均有商品提供）的注射器过滤，过滤后直接以注射器冲洗。②滤纸最好用无纤维吸水滤纸。③冲洗在胶金标记技术上是个决定性关键，仅次于抗体血清的纯度。笔者的体会是一般应漂洗3×5min，以注射器喷水漂洗效果优于杯漂洗法，但漂洗水流需与网面平行，勿使水压破坏切片。