二、研究方法

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1.组织切片中T淋巴细胞80年代以前多用玫瑰花瓣试验和酸性酯酶方法进行组织切片中T淋巴细胞研究,特异性较差。近年来多用OKT,Leu或CD等系列T淋巴细胞单克隆抗体进行研究,特异性高,可以分类出各种亚群。免疫组化染色中应注意以下几个方面:

(1)抗体的选择:根据不同目的选择相应的抗体,如要对人胃肠道组织进行研究,可选用OKT系统单抗;对鼠类等进行研究可选用Leu 或Thy系列。如要研究辅助性T淋巴细胞可用OKT4或CD4;研究抑制性T淋巴细胞可用OKT8或CD8等单克隆抗体。

(2)组织加工方法选择:目前所研究的特异性T淋巴细胞抗原决定簇多位于细胞膜上,用陈旧或普通组织固定和加工方法可能使抗原破坏,应采用新鲜组织和低温处理。具体方法是:手术或活检获得的组织立即用液氮冷冻,或用OCT复合物包埋后再放入液氮中,便于切片,Cryostat冰冻切片后室温下风干,用4纯乙醇或丙酮固定10min,PBS冲洗后即可进行免疫细胞化学染色。

(3)染色方法的选择:因抗原较微量,而且位于细胞膜,应采取敏感性强、特异性高、非特异性着色少的方法。虽然有报道采用间接荧光或间接酶标技术也能显示特异性T淋巴细胞,我们推荐最好采用PAP或ABC染色技术。具体方法参阅第三,四章 。

2.粘膜分离液中T淋巴细胞一定重量粘膜组织中分离出来的T淋巴细胞也可以用免疫细胞化学进行定量和定性研究。下面介绍用间接免疫荧光技术研究IEL的大致过程:

(1)将手术取得的肠管纵形剪开,将上皮层与固有层分离。

(2)上皮层放在无镁离子、含100U青霉素和链霉素及0.2%叠氮纳的PB中清洗,无血液和其它杂质后用解剖剪将组织剪碎,用匀浆器磨碎或用超声粉碎或用胶原酶溶解上皮细胞。

(3)匀浆液通过脱脂棉、尼龙筛(只允许淋巴细胞滤过,除去粘液、碎屑和上皮细胞凝集块)或金属网(200目)获得淋巴细胞悬液。

(4)将硅化玻璃球高压消毒,冲洗和平衡后将悬浮液过柱,得到的细胞液直接计数。也可以用淋巴细胞分离液提取,用台盼蓝测定其活性,并加10%FCS-RPMI细胞培养液,淋巴细胞数应达5×106/ml。

(5)试管内加0.1ml细胞液后加OKT系列单抗0.1ml,同时用另一试管加0.1mlPBS作对照。混合液在4℃放置30~60min(也可以在冰箱过夜)后,PBS(含RPMI)冲洗3次,离心后细胞沉淀物再加PBS至0.1ml。

(6)加0.1mlFITC标记的抗鼠IgG(根据工作效价),4℃放置20~30min,PBS洗3次,离心后加在红细胞计数板上,荧光显微镜观察。

(7)阳性细胞为细胞膜上有绿色荧光,有的呈颗粒样,随细胞滚动。荧光镜下可计算200个淋巴细胞中阳性细胞所占的百分率,或根据血细胞计数板中阳性细胞算出细胞总数及百分率。

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