四、双引物法标记DNA探针法

反应在0.5ml管内进行，反应体积为50μl，内含50mmol/l Tris(pH7.5)、10mmol/l Mg－Cl₂、10mmol/L β-巯基乙醇和500μg BSA/ml，引物片段1和2各90ng，模板DNA0.1μg,[α-³²P]dCTp 1.5×10⁶Bq，dATp 、dGTP和dTTP各200μmol/L。标记反应包括3个步骤：

（1）变性：反应管在95℃水浴5min，然后离心；

（2）退火：37℃水浴2min；

（3）延伸：加入DNA聚合酶i 1u，37℃水浴18min。重复上述变性、退火、延伸过程1～2次，分别进行其标记率测定：取0.5μl反应液分别点于两张滤纸片上，烤干。一张经0.6mol/L三氯醋酸（TCA）、0.3mol/l TCA依次洗涤，每次10min，然后再用无水乙醇，醇醚混合液和乙醚洗涤各5min。两张滤纸分别放入闪烁瓶内，测定cpm值，达到10⁸cpm/μg DNA以上。