五、在IGSS染色中常见技术问题和对策

（一）背景染色产生的原因和防止方法

（1）第一抗体或金标抗体稀释度不合适，一般容易犯抗体使用过浓的毛病，认为抗体越浓越好，结果适得其反。应该先作方阵滴定，优选最佳稀释倍数（见第一章　），即可避免非特异性染色，又可节　省抗体。

（2）使用正常箅清封闭和在抗体稀释液中加入牛血清白蛋白，可以减少非特异吸附，降低背景染色。

（3）显色的器皿必须彻底清洗，化学试剂必需用三蒸馏水配制。

（4）乳酸银和硝酸银的显色在避光的环境中反应。醋酸银则可在有光的环境中显色。

（5）显色时切片应垂直放置在银显影液中，使过多的银颗粒下沉，如水平放置易沉淀于切片上。

（6）控制反应时间，显影液加入适量的阿拉伯胶或明胶可以延缓反应速度，避免形成过多的还原银，非特异地吸附在切片上。一般加入明胶1%～2%，效果比较满意，反应时间根据室温而定，室温25^℃左右显色时间10～15min，室温在20℃以下，显色时间20～30min左右。

（7）洗涤：使用TBS时最好加入0.05%～0.1%的Triton X-100或Tween 80，可以洗脱掉组织表面发生非特异性吸附的污染蛋白，防止出现背景的非特异染色。

（二）背景染色已发生应如何消除

（1）2%硫代硫酸钠，1%铁氰化钾等量混合，加在切片上至背景无色为止。

（2）2%铁氰化钾和1%溴化钾等量混合作用1min水冲洗，然后加上2%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠脱色，至背景干净为止。

（3）0.1%重铬酸钾加0.25%浓硫酸，在显微镜下控制脱色时间，至阳性结果清楚，无背景为止。然后用5%硫代硫酸钠漂白。注意时间不要过长，以免阳性结果被脱掉。

（4）用0.3%～1%的H₂O₂处理切片也可消除背景的银颗粒。但必须在显微镜下控制脱水时间，防止把阳性结果脱色。

（三）彩色显影背景过染的处理方法

彩色免疫金银法，在胶体金技术中是一个很大的突破，它的优点是结果鲜明，对比度好，但是在彩色显影过程中时间过长，背景可有一些着色，彩色显影的时间控制很重要。一旦过染可用以下方法处理。

（1）纯酒精滴到切片上3～5s,立即冲掉，水洗，充分地把酒精洗掉，如果洗不彻底，造成阳性结果脱色。

（2）75%的酒精滴到切片上1min，立即冲掉，脱色不能时间过长，过长后阳性结果全部脱掉。