五、缺口平移法标记生物素DNA探针(二步法)
取HBV质粒DNA0.5μg,DNase I(SABC)2pg, 10×NBTμl,三蒸水补足体积至10μl,37℃,15min;加5mmol/l dATP dGTP dCTP Bio –11- dUTP各2μl,10×NBt 4μl,三蒸水补足体积至10μl,37℃,15min;三蒸水补足体积至49μl,DNA聚合酶i 5u,混匀,14℃过夜,加0.5mmol/l ED-TA(Ph8.0)1μl终止反应。
已标记探针的提纯:10mg/ml tRNA 2μl,10mmol/L Tris –HCl (pH7.5)150μl,2.5倍体积的95%乙醇,置液氮中15min或-20℃过夜。15000r/min,离心10min,真空干燥后,溶于适量三蒸水中,即为纯化的探针,-20℃备用。
使用闭环或线性双链质粒DNA,或分离的双链DNA片段均可进行此法标记,全质粒标记敏感性较高,因为标记物可同时掺入载体DNA。
此法也可用于放射性同位素和地辛标记DNA法。
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