一、抗原的稳定性

免疫细胞化学和组织化学就是检查、鉴定、定位和示踪组织中各种抗原成分。在组织加工过程中，必须保持抗原的形态、结构、抗原性和在组织中的位置保持不变，不引起组织产生自发荧光及其它非特异性着色。原则上越新鲜的组织越适于进行免疫细胞化学和免疫组织化学研究。

1．组织切片标本经胃镜、小肠镜和大肠镜等内窥镜取材可以在直视下根据研究的内容在不同部位进行取材，即准确又方便。一般组织块直径多在0.5～1.0mm左右，适合进行各种抗原的研究。

（1）取材方法：将取材部位调整到内窥镜视野中央，使活检钳与粘膜面垂直，然后钳取。活检钳应尽量下压深取达粘膜全层。取出活检钳并打开活检器时要轻，防止粘膜撕裂。立即将活检组织轻轻在粘在滤纸上，并尽量使粘膜面与滤纸平行。

（2）组织固定：根据所查抗原的种类采取相应的固定方法。我们的体会是：对某些蛋白类抗原，如免疫球蛋白、SC、CEA等一般用95%冷酒精固定较好。95%乙醇不但能固定蛋白抗原，而且保持与抗体的免疫反应能力，同样可以进行HE染色。除组织有部分收缩外，组织成分和抗原位置没有大的改变，组织块可以在冰箱内长期保存。我们对保存26个月的冷酒精固定组织进行CEA和SC的研究，效果仍很好。对多肽类激素的研究可以用4%多聚甲醛缓冲淮，Bouin 缓冲液或福尔马林缓冲液进行固定，或直接液氮固定后冷冻切片。冷酒精固定的组织不宜进行多肽类激素的研究。对陈旧性福尔马林的固定的组织可以在抗原表面形成蛋白衣，直接影响抗原抗体反应。有人用胰酶消化后暴露抗原部位，进行胃泌素细胞的免疫细胞化学染色，也获得较好结果。要进行胃肠道多肽类神经的免疫组化研究，可用含Triton的固定液和冰冻切片。对小白鼠等动物可向血管内注射多聚甲醛等固定剂，然后处死取材。进行细胞膜抗原的单克隆抗体研究时最好用Cryostat冰冻切片，然后丙酮或乙醇固定10min左右。

（3）组织加工：温度对抗原抗体均有影响。一般在4^℃进行脱水和透明。包埋选用低熔点蜡（52℃～56℃），浸蜡时间以20min左右为宜（因组织块较小）。脱蜡和脱二甲苯也应在低温下进行。

（4）组织保存及切片：石蜡包埋或其它方法加工后最好立即进行切片和免疫细胞化学染色。根据不同的抗原也可以在低温下保存一段时间后再染色。组织切片的免疫细胞化学染色实际上使切面的抗原暴露后直接与抗体相结合，一般组织切片厚度以5～7μm为宜。如果观察神经纤维则以10～20μm为好。太厚则透射光不易通过，影响观察，易出现自发荧光。如果进行免疫电镜观察，最好超薄切片。

2．涂片或印片标本拉网和内窥镜下获得的胃肠道分泌物等可直接涂片，空气干燥，再用乙醇固定后进行免疫细胞化学染色。涂片和印片缺乏明确的组织结构，标本中常常混有不同形态的组织细胞和其它蛋白等无定形成份，很容易造成假阳性，观察时应当特别注意。

3．组织分离细胞将手术或活检组织块用机械研磨或胶原酶消化等方面可分离出细胞，加入培养基，在试管内进行活细胞免疫荧光或免疫酶等免疫细胞化学染色。流式细胞仪进行定量和定性分析。此法对细胞膜抗原的研究有较大价值。我们在试管内用免疫荧光技术对周围血分离的单核样细胞进行T淋巴细胞亚群和B淋巴细胞的研究中，发现OKT₃、OKT₄、OKT₈和Ia的荧光均分布于细胞膜，随着细胞的滚动，犹如火球，非常清晰。