一、FCM应用的技术途径

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FCM是通过测量细胞的多种参量来获取信息的。细胞参数分为结构参量和功能参量两大类。结构参量主要用于描述细胞的化学组分和形态特征;功能参量主要是描述细胞整体的理化和生物特性。这些参量有的需要经荧光标记方可测定,有的并不需要荧光标记。DNA以及RNA的含量,蛋白总含量、胞内pH值和细胞大小等为结构参数;细胞周期动力学、特殊配体的鉴定、特殊细胞的生物活性等则为功能参数。

1.DNA和RNA的测量和分析DNA和RNA的含量可以用多种荧光探针标记后测出。对细胞内DNA含量的测定可用于细胞生物学方面的研究和临床肿瘤学的诊断;测量RNA的含量可用于血液中的网织红细胞的检测和计数;DNA和RNA含量的测定可以用于区别细胞周期中的G0和G1期。常用的荧光探针有吖啶橙(AO,Acridine·orange)、派洛宁Y(PY,Pyronine Y)、HO(Hoechst)系列和色霉素A3(CA3)等。利用HO/CA3双染色还可分析DNA的碱基组成。还可以结合Brdu (Bromodeoxyuridine, 溴脱氧尿嘧啶核苷)单克隆抗体免疫荧光来测定细胞内DNA合成。

2.蛋白质总量测定用FCM可以测定细胞中蛋白的总含量,以检测一个细胞群体生长和代谢的状态,或区别具有不同蛋白含量的细胞亚群,如血液中的白细胞的分类。检测总蛋白的常用荧光探针为异硫氰基荧光素(FITC,Fluorescein isothiocyanate),FITC以共价键方式与蛋白上带正电的残基结合。

3.特殊配体的测定配体是与不同的细胞结构特异结合很强的各种大分子和小分子,通过对特异性的荧光标记的配体的测定可以获得不少有关结构参量和功能参量的信息。例如用标记的外源凝集素可检测细胞表面糖;用标记抗体可测表面抗原;用标记多聚阳离子可检测细胞表面电荷;用标记的激素、生长因子、神经递质和病毒等可检测细胞受体;用标记的大分子、微生物等可检测细胞的内吞性;用荧光素标记的亲和素以及带有DUTP的生物素衍生物的DNA探针跟靶细胞的DNA杂交能够检测原位的特殊基因等。这方面的应用范围广、有前途,已经成为研究细胞和组织中的抗原、基因和各种生化过程的强有力的新技术。用于这方面工作的荧光探针主要有FITC、若丹明系列(如四甲基异硫氰基若丹明TRITC、异硫氰基若丹明X-RITc 和美国德州红等)、藻胆蛋白系列等。由于各种荧光探针具有不同的光谱特性,在使用中要注意正确地使用激光光源和滤片。

4.生物活性的测定就生物流行性来说,主要包括两方面工作:①细胞本身的死活;②活细胞生物功能发挥的强弱。前项工作单一,后项工作要复杂得多。FCM用来判断细胞死活的常用荧光探针有二大类:一类是能透过活的细胞膜进入细胞内而发出荧光的物质;例如下醋酸酯荧光素(FDA,flourescein Diacetate)它可被活细胞持留而发出黄绿色荧光;若细胞有损伤则会从细胞中流失,观察不到荧光。另一类是不能透过活细胞膜,但能对固定的细胞及膜有破损的细胞的核进行染色,例如碘化丙啶(PI,Propidium iodide)和溴化乙锭(EB,Ethidiumbromide )就是常用的第二类荧光探针。

用FCM来测定活细胞生物功能发挥方面和性能的指标很多。例如可用来测细胞膜电位、细胞内pH值和细胞内钙等,这些都和细胞的激活密切相关。FCM也可用来测膜结构的流动性或微粘度等。有报告可以用FCM代替51Cr的放射免疫分析来测定天然杀伤细胞(NK, Natu-ral killer cells)对靶细胞毒理学活性的大小。

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  1. FCM应用的技术途径《实用免疫细胞与核酸》
  2. FCM对外周白细胞的免疫荧光分析《实用免疫细胞与核酸》
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