三、ICC在细胞功能研究中的应用

形态学研究目的之一是揭示组织细胞结构特征及其功能意义。利用ICC显示给与细胞增殖标记物，是组织细胞学研究中形态和功能相结合的重要手段之一。目前常用的细胞增殖标记物有4种，Brdu (5—bromo—2--deoxyuridine), DNApolymerase α,PCNA （Proliferating cell nuclear antigen）,Ki—67 等，相对应的4种单克隆抗体均有商品出售。因组织细胞内无内源性Brdu存在，所以Brdu应用较广。Brdu为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。

笔者在观察大鼠小肠上皮细胞增殖、代谢时，一次腹腔注射Brdu（Sigma）4mg/150～200g体重，分别在给药后1h和1、2、3、5、7天取小肠，应用抗Brdu抗体，ICC染色，可见肠上皮细胞从肠腺至绒毛顶端增生移行。在计数免疫活性细胞研究中，一次注射Brdu后，计数瞬间进入S期细胞数或连续多次注射Brdu，计数注射Brdu期间进入S期细胞的总和。另外在临床上，术前或术中给与Brdu，判断脑肿瘤细胞分化程度、恶性度等亦较常用。

掺入双链DNA内的Brdu，以氢链与腺嘌呤结合，不能直接与抗Brdu抗体反应，需经解链使Brdu暴露方能被染色。常用的解链方法为盐酸加热、蛋白酶处理等，使DNA双链部分单链化，抗Brdu小鼠单克隆抗体与增殖细胞核内的Brdu结合，再经酶标抗小鼠IgG抗体孵育、呈色，显示进入S期细胞的情况。

盐酸和蛋白酶处理等可引起其它抗原或组织形态发生变化。为此，Conchoroff(1985)等制备了一种单克隆抗体（Bu—1），其培养液上清能与双链DNA的Brdu反应，因为培养液上清中含有DNA酶，可分解双链DNA，显露Brdu，达到染色目的。笔者采用戊二醛固定后，胃蛋白酶—盐酸处理，亦得到了良好的染色结果。简述染色步骤如下（Matsuna,1989）：

（1）冰冻切片/石蜡切片准备同前。

（2）TBS冲洗，Baker’s液固定10min，室温。

（3）TBS冲洗，1%戊二醛固定5～10min，室温。

（4）双蒸水冲洗，0.006%(冰冻切片)或0.02%(石蜡切片)胃蛋白酶/0.01mol/l HCl,37℃，10min。

（5）双蒸水冲洗，4N HCl 30min，室温。

（6）PBS充分冲洗，使切片pH回至中性。

（7）封闭性阻断剂20min，室温。

（8）抗Brdu抗体孵育1～2h室温或4℃过夜。

（9）PBS冲洗，HRP标记抗小鼠IgG抗体45min，室温。

（10）PBS冲洗，DAB/H2O2呈色。

（11）轻度苏木精复染，脱水透明，封片同前。分裂增殖细胞核呈棕褐色。

采用双重或多重染色、观察何种细胞分裂增殖时，首先应染色其它抗原物质，最后显示Brdu。通常在第一种抗体呈色后，再经1%戊二醛固定5～10min，重复上述程序，均可获得较满意的染色结果，分裂细胞核呈棕褐色；显示其它抗原用ALP标记抗体，则细胞浆为红色（FR）或蓝色（FB）。