四、连接酶链式反应

该技术是Landegren等人于1988年为检出序列中点突变而设计、发明的。合成一对引物A、B，它们完成覆盖了靶序列。经退火与靶序列结合后，A、B间留下一个缺口（nick），加入连接酶封闭缺品，两引物成靶序列完整的互补链。如果靶序列中有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，变性后引物仍是两个。Lan－degren用生物素标记引物A，用³²P标记引物B。用亲和素包被的琼脂糖珠与连接产物反应，检测其放射性。显然，当靶序列中存在点突变时，检测结果是阴性的。用这种方式，Landegren将人β-珠蛋白βA、βC、βS三个等位基因区别开来。Wu等人又引入PCR的原理，在连接反应后，变性、退火、再连接，少量的靶序列就被扩增出来。Barany于1991年报道了耐热连接酶-Taq连接酶的发现及其在LCR中的应用，为LCR的实用化奠定了基础。实际操作时引物为4个，A、A、　A’和B、B’，分别与靶序列的正负链互补。每次连接反应的产物又可在下一轮反应中当模板，靶序列以指数形式扩增出来。用上面提到的标记检测方法，即可检测靶序列中有无点突变。

LCR的特异性首先取决于引物与模板的特异结合，其次Taq连接酶作用的特异性，即Taq连接酶是否仅连接与靶序列完全互补的引物。实验表明Taq连接酶的非特异活性是较低的（<1%）。控制模板、酶的浓度，使反应在接近Taq酶的温度下进行，还可进一步降低非特异连接率。Barany用这一技术，将极少量（<200个分子）的βA、βC和βS区别开来。

LCR的扩增效率与PCR相当。由于有很高的信噪比，其敏感性也很高。用Taq连接酶做LCR只在两个保温点的循环（94℃、1min和65℃、4min）。产物检测也非常方便、敏感。因此可以说LCR是目前检测已知序列中有无点突变的最佳方法。