四、血浆

1．直接测定

（1）加酶抑制剂：准确采全血若干毫升，注入预冷的加有①抗凝剂0.3mol/l EDTA·2Na（乙二胺四乙酸二钠）溶液（每毫升全血20μl）、或1%肝素（每毫升全血10μl）；②抑肽酶（每毫升全血500单位）的塑料指形管中，迅速低温离心，取血浆低温保存待测。

抑肽酶有液体的（标签写的有每毫升含多少单位）与固体的（每毫升含12TIU，1TIU=900KIU，即每毫克含10800单位）。固体的抑肽酶可用生理盐水溶解，使之每20μl含500单位。

（2）酸化处理：每毫升血浆加1mol/l HCl 0.2ml，低温保存待测。测定前加1mol/l NaOH 0.2ml。

以上两种方法，任选一种即可。

2．间接测定 血标本经提取后，可去除蛋白质等干扰因素，并使微量的生物活性肽浓缩，但较费时，成本也高。常用的提取方法有：

（1）柱层析提取法：有多种层析柱可供提取不同的神经肽，其中较为方便的是用Sep-pak C₁₈层析柱提取。主要步骤步：

①柱的预处理：该柱有两头，长头连接注射器，可注入溶液与样品，短头为排出口。预处理时注入乙腈10ml。蒸馏水20ml，使柱中的生物胶活化。

②注入样品（如血浆、脑脊液、腹水、尿等）：样品中的水份流出，生物活性肽、蛋白及杂质等吸附在生物胶上。血浆上柱前，如先去除蛋白，可增加柱子的使用时间。]

③淋洗：用4%HAC溶液100ml注入柱中，以洗去一些杂质。

④洗脱：用7ml酸性乙腈（按容积算，每100ml中含有乙腈75ml、HAC4ml、蒸馏水21ml）作为洗脱剂，注入柱中，把生物活性肽洗脱下来，收集在塑料指形管中。

⑤清洗：用乙腈、蒸馏水清洗柱子，以备后用。

⑥将洗脱液吹干，低温保存待测。测定时可加入一定量的缓冲液溶解。

Sep-Pak C₁₈柱层析，也可用于制备标记抗原时的层析纯化。

（2）加膜藻土提取法：

①抽血：用一次性塑料注射器抽取受试者静脉血4ml，置于加有肝素（125单位/ml 全血）指形管中。

②分离血浆：在4^℃下离心，取出血浆。

③血浆酸化：取2ml血浆，加入1mol/l HCl 0.5ml, 摇匀。

④吸附：加入0.5%藻土悬液2ml，在水平震荡器上震30min。离心，去上清，留沉淀。

0．5%藻土县液（Fuller’s earth)的配制：

0.5gFuller’s earth

0.1gDextran T₇₀

100ml去离子水

⑤洗脱：在沉淀管中加入80%酸性丙酮1ml，在漩涡振荡器上振2min，离心，取上清置于经硅化的玻管中。

80%酸性丙酮的配制：

80ml丙酮

20ml1mol/L HCl

⑥去脂：加入石油醚1ml，摇匀，脂肪溶解在石油醚中，分层后吸去上层。

⑦干燥：下层液体，置于37℃水浴中，用氮气（或空气）吹干。

⑧低温保存待测。测定时用一定量缓冲液溶解。

（3）有机溶剂提取法：常用的有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等。将溶剂按一定比例，加入标本内，混匀、振荡、离心，取上清吹干，冷藏待测。通常在有机溶剂中加入适量的酸。

在这些方法中，以柱层析法最稳定、准确，但成本高，推广不易。加膜藻土法，提取率较高，但操作复杂、费时。有机溶剂提取法操作方便，成本也低，虽稳定性较差。