二、转录依赖的扩增系统

扩增样本中的RNA，一般要先将其逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，能否将RNA靶序列直接扩增出来呢？Kwok等人发明了TAS来解决这一问题。结合应用葡聚糖珠寡核苷酸杂交技术可进一步提高方法的特异性和效率。其原理是：制备引物A、B，引物A与待检RNA3’端互补，并有一T⁷RNA多聚酶的识别结合位点。逆转录酶以A为起点合成cDNA；引物B与此cDNA3’端互补，逆转录酶同时还具有RnaseH和DNA多聚酶的活性，又可利用引物B合成cDNA的第二链。RNA多聚酶以此双链cDNA为模板转录出与待检RN-一样的RNA，这些RNA又进入下轮循环。RNA多聚酶从一个模板可以转录出10～10³个拷贝，因此反应中待检RNA拷贝数以10的指数方式增加，较PCR高得多。扩增产物用葡聚糖珠夹心杂交法检测：产物先与标记的探针杂交，再与包被在葡聚糖珠上的另一互补寡核苷酸（与标记探针互补的位置不同）杂交、检测。该方法同一般杂交检测技术相比，特异性要高出许多。

TAS主要特点是扩增效率极高，由于拷贝数是以10指数递增，只有6个循环，靶序列即能达到2×10⁶个拷贝。由此而来的另一个特点是特异性很高，在一般的RNa PCR扩增中，由于逆转录酶和Taq多聚酶均无较对活性，要发生错掺，循环次数越多，错掺率越高。TAS仅需循环4～6次，将错掺率降低了4/5。用葡聚糖珠夹心杂交法，又进一步提高了特异性。目前认为TAS是扩增RNA的首选方法。