九、玻片PCR

《实用免疫细胞与核酸》书籍目录

在聚丙烯管中可以对多种含膜板材料进行PCR,而在显微玻片上用组织细胞涂片或切片直接进行DNA扩增的方法就称为玻片PCR(Slide-PCR)。

锚定PCR原理示意图

图22-3 锚定PCR原理示意图

先将细胞涂片或呈单层细胞,然后用甲醇/醋酸(3:1,V/V)、Carnoy溶液、无水乙醇或4%多聚甲醛溶液固定5~15min。用蒸馏水冲洗,干燥,直接使用或保存于-20℃备用。在玻片上划20mm×28mm为免疫组化反应区。加入30μl PCR反应混合液,其中含10mmol/L TrispH8.3,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,200μmol/l dNTPs,100nmol/L引物,0.01%(V/V)明胶,0.2%BSA, 2.5u/100μl Taq酶。然后盖上22mm×40mm的盖玻片,边缘用石蜡油封好。把玻片放入PCR热循环仪金属块上,使金属块与样品呈最大程度接触,同在聚丙烯管中一样,进行30~40个循环。对于较短的扩增片段在后期循环中变性温度可降低。反应后,将致冷玻片放在氯仿中除去大部分石蜡油,但不取出盖玻片,用一个尖镊子轻轻拈起盖玻片一角,在相对的一角中PCR反应混合液呈半月形液面,用移液器回收。一般可回收25μl混合液,将反应产物进行琼脂糖电泳或用套式PCR引物按标准PCR进行重新扩增。片上扩增物可做原位杂交显示。

在Slide-PCR中,需0.1%~1%的BSA。加入BSA可以保证扩增结果,但效率不一定很高。明胶(至少0.0001%),对扩增1kb左右的靶DNA十分重要。但对小片段扩增结果影响不大。不同的样品提取方法或固定法对Slide-PCR都可行。

Silde-PCR的机理可能是在起始变性过程中一部分DNA从细胞中洗提出来,然后在细胞和玻片的水相中进行PCR。用地高辛标记的人全基因组DNA探针杂交表明在起始循环中DNA极微量,而30个循环后很丰富。常规细胞染色表明只有少量的形态改变。

Silde-PCR对于玻片上的细胞样品提供了一种较好的方法,而不必再把这些样品从玻片上括下来,使操作简便,污染减少。本方法对于原样品量极微且需病史追踪保存的(如子宫颈涂片或涂片)具有实用价值。

1000余本中医古籍txt电子书免费下载

下载《实用免疫细胞与核酸》 电子书打不开?

下载所有中医书籍

返回《实用免疫细胞与核酸》书籍目录
  1. 玻片PCR《实用免疫细胞与核酸》
  2. 玻璃体寄生虫《眼科学》
  3. 剥死马马骨伤人方三首《外台秘要》
  4. 玻璃体积血《眼科学》
  5. 剥苔《中医名词词典》
  6. 玻璃体混浊《眼科学》
  7. 剥苔《中医词典》
  8. 玻璃体混浊《老年百病防治》
  9. 《证类本草》
  10. 玻璃体混浊《百病自测》
  11. 《本草求真》
  12. 玻璃体出血《眼科学》
  13. 《本经逢原》
  14. 玻璃体病《眼科学》
  15. 菠(菠菜)《食疗本草》
  16. 玻璃体变性《眼科学》
  17. 菠菜《本草纲目》
  18. 玻璃体《眼科学》
  19. 菠菜《药笼小品》
  20. 玻璃《证类本草》
  21. 菠菜《食物疗法》
  22. 波斯白矾《证类本草》
  23. 菠菜《饮食须知》
  24. 波斯白矾《海药本草》
  25. 菠菜《医学入门》
  26. 波罗蜜《滇南本草》
  27. 菠菜《本草从新》
  28. 波罗蜜《本草纲目》
  29. 菠菜《得配本草》
  30. 《饮膳正要》
  31. 菠菜《本草分经》