三、铁蛋白与免疫球蛋白的结合
一般用低分子量的双功能试剂把两者联结起来,常用的双功能试剂有间苯二甲基二异氰酸盐(简写XC)。甲苯2,4二异氰酸盐(简写TC)。邻茴香胺(简写BDD);对,二氟一间,间,二硝基二苯矾(简写FNPS)和戊二醛。近年来,普遍认为戊二醛作为联结剂效果较好,对抗体活性影响小,标记抗体产量高。分为一步法和二步法,现简介如下:
1.一步法 以15mg 铁蛋白和3mg球蛋白溶于0.9ml 0.1mol/L磷酸缓冲液中,pH7.0,加入0.1ml新鲜配制的戊二醛溶液,使其最终浓度为 0.005%~0.05%, 加入0.02%叠氮钠(NaN3)防腐,此混合液置37℃24h,无需搅拌,结合完毕后加0.01mol/L赖氨酸中止反应。
2.二步法
(1)在含50~80mg铁蛋白的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中,加入稀释的戊二醛,使其最终浓度为0.05%~0.15%,总体积为1ml。
(2)置37℃作用2h后,经葡聚糖G—25 滤柱,除去未结合的戊二醛。为避免不必要的稀释,只收集脱峰的中间部分。然后加入球蛋白(铁蛋白与球蛋白之比为5:1)即铁蛋白最终浓度为15mg/ml,球蛋白3mg/ml。
(3)混合液置37℃,作用12h(无需搅拌),加入0.01mol/L 的赖氨酸以中止进一步交联。两步反应都需在0.02% NaN2防腐条件下进行。
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