（二）染色

1．ICC与荧光抗体法结合 首先染色显示A抗原，DAB/H2O2呈色，继之用间接（直接）荧光抗体法显示B抗原，于光镜和荧光显微镜下观察，比较两种抗原的分布。因DAB终产物能够沿其表面向周围迁移，尤其是DAB浓度略高、反应时间稍长时，形成的终产物较大，可以遮盖该抗原抗体的反应部位，故两种染色间很少出现交叉反应。该双重染色的方法主要适于显示两种抗原分布不同细胞内，尤其A抗原浓度高、反应较强、DAB终产物较牢固的情况。

2．同一切片的再度染色法（Restanining Method）　 用ICC法显示神经递质、神经肽等在神经细胞/神经纤维内共存时，连续切片、镜影切片及重叠染色往往很难判断同一神经纤维的共染，为此建立了同一切片再度染色法。该方法利用4—氯—1—萘酚（CN）产物在酒精内的可溶性及酸处理能使抗原抗体解离的特点，首先第一种抗原用CN发色，染色阳性部位摄影；继之，用低 pH的甘氨酸/盐酸缓冲液（0.2mol/L甘氨酸—盐酸缓冲液，pH2.2～2.3,含0.5mol/l NaCl）或盐酸孵育切片，去除第一次染色的抗体，再经50%、70%、90%、100%酒精脱CN色，PBS洗净后染色第二种抗原，DAB呈色后，摄影比较同一部位是否两种抗原共存在于同一神经纤维。为验证盐酸等处理效果，可省略第二次染色的特异性抗体，仅重复酶标抗体的染色，观察第一抗原阳性部位是否出现重叠着色。

3．同一切片、不同呈色的双重染色ICC法显示A抗原时，用DAB/H2O2呈色，终产物为棕褐色；继之，B抗原染色，CN/H2O2呈色，反应产物深蓝色，光镜下可同时观察两种抗原的局部所在。为避免第二次染色的抗体与第一次染色抗体之间的交叉反应，在B抗原染色前，可用酸性缓冲液处理切片，去除第一次反应的抗体，方法同2。该方法DAB和CN的色彩对比不鲜明，而且HRP酶活性较强，酸性缓冲液中，亦能残存部位活性，所以可能有混合颜色出现，判定同一细胞内两种抗原共存常常有一定难度。

4．两种酶标抗体的双重染色 分别用HRP和ALP标记间接抗体，ICC染色，显示两种不同的抗原。首先显示A抗原，HRP酶标记间接抗体，CN/H2O2呈色；继之显示B抗原，ALP标记间接抗体，FR/As—Mx呈色，轻度甲基绿/苏木精复染细胞核，一般可获得理想的结果，组织结构清晰，色彩对比鲜明。笔者应用此方法，显示小鼠脾脏巨噬细胞标记物ED1、ED2和ED3分布时，得到了较佳的染色效果。尽管该双重染色法应用了不同的酶标抗体，但常用其二者来自同一种属的抗体，所以在第一次染色部位，往往有重叠染色的现象。我们的经验为先染色反应较弱、含量较少的抗原，第一抗体用较高稀释度，酶标抗体则用高浓度（低稀释度），尽量使所有的第一抗体均被饱和，防止其与第二种酶标抗体结合；第二种抗体染色前，应用PBS充分洗净；第二种酶标抗体可用较高的稀释度。这样可避免“非特异”性重叠着色，色彩对比亦较理想。

5．不同种属来源的抗体的双重染色上述几种双重染色法，均系来自同一种属的特异抗体和相同/不同的酶标抗体，所以两次染色间常常有交叉反应。较理想的方法是用不同种属动物制备特异性抗体和两种酶标抗体的双重染色，例如显示A抗原为小鼠单克隆抗体，HRP标记兔抗鼠IgG；显示B抗原为豚鼠单克隆抗体，ALP标记羊（驴）抗豚鼠IgG ，将两种抗体稀释最佳工作液浓度1/2，充分混合、孵育同一张切片，亦可分别染色。CN/H2O2呈色后，FR—As—Mx呈色，光镜下观察两种抗原的分布。该方法两种抗体间无交叉反应，特异性较高，即使细胞内抗原量较少也能发现。但当两种抗原存在同一部位，其中之一浓度较高、占绝对优势时，亦将妨碍另一种抗原的染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。该方法要分别制备4种不同的特异性抗体和酶标抗体，费时费力，实际应用受一定限制。

上述两种双重染色，两种酶标抗体的非特异性着色可能迭加，致使背景着色较单独使用时增强，S/N下降，所以各研究室应根据实验目的和条件，合理选择染色方法为宜。简述染色步骤如下：

（1）切片准备同一般间接法。

（2）切片孵育A抗原，特异抗体1～2h室温。

（3）PBS冲洗，孵育HRP标记抗体45min，室温。

（4）PBS冲洗，孵育B抗原的特异抗体1～2h，室温。充分漂洗，孵育ALP标记抗体，45～60min。

（5）PBS冲洗，Baker’液固定5min，室温，PBS洗净。

（6）呈色CN/H2O2/TBS 15min，室温。

（7）Tris—HCl(pH9.0)冲洗后，Fr AS—Mx呈色8min,37℃。

（8）轻度PBS冲洗，1%戊二 醛固定5min。

（9）水洗，轻度复染细胞核，水溶性封固剂封片。

（10）光镜下观察。双重标记细胞呈暗红至深紫色，与单独阳性细胞有明显区别。