一、同位素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序

（1）切片入PBS冲洗5min，最好是将切片漂洗于灭菌器皿中。

（2）0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。

（3）0.4%Triton X-100 PBS 15min。

（4）1μg/ml蛋白酶K，37℃保温30min。

（5）4%多聚甲醛PBS固定5min 。

（6）PBS冲洗2×3min。

（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配）10min。

（8）2×SSC冲洗10min。

（9）杂交：如是cDNA探针用前需进行变性处理，载片法时将切片在空气中晾干，加含探针的杂交液10μl于切片上，盖上22×22mm的硅化盖片或相当大小看蜡膜，³H标记探针每10μl杂交液含1×10⁵cpm探针，³²P或³⁵S标记探针每10μl杂交液含5×10⁵cpm探针；如是漂浮切片，则用灭菌吸水纸将切片水份尽量吸干，然后入杂交液，探针浓度和载片法一样。入杂交液后43℃保温12～16h。

（10）4×SSc 37℃冲洗10～30min。

（11）2×SSC（如为RNA探针则含20μg/ml RNase）37℃冲洗30min。

（12）1×SSC和0.1×SSc 37℃分别冲洗30min。

（13）PBS冲洗2×5min。（转录ISHH）

（14）0.5%H₂O₂PBS室温30min。

（15）1%BSA 37℃，30min 。

（16）第一抗体，4℃孵育16～24h。

（17）PBS冲洗4×5min。

（18）第二抗体37℃，1h。

（19）PBS冲洗3×5min。

（20）兔PAp 37℃，1h 。

（21）PBS冲洗3×5min。

（22）DAB显色液5～10min（DAB显色液：0.05%DAB + 0.03% H₂O₂PBS液配）。

（23）PBS冲洗3×5min。如是漂浮切片则将其贴于涂有粘附剂的载片上，晾干。

（24）切片入70%，85%，95%和2个100%酒精脱水，空气干燥。

（25）在暗室涂布乳胶（乳胶配制：乳胶原液：0.6mol/L醋酸胺=1：1），晾干，装入自显影暗盒。

（26）4℃曝光：³H标记探针4～8周，³⁵S标记探针1～4周，³²P标记探针7～10天。

（27）D₁₉₆显影液，20℃显影5～10min。

（28）自来水冲洗数秒。

（29）F₅坚膜定影液10min。

（30）自来水冲洗15min。

（31）切片温箱烤干，脱水，透明，封片。

结果：蛋白或多肽免疫反应阳性细胞为棕色胞质，而其相应mRNA为黑色银颗粒聚集。