(二)蛋白A-金(PAG)放大法
为了得到更明确的染色结果,在用IGS方法定位细胞抗原时可采用搭桥法,使IGS得到放大,这里介绍一种用抗A蛋白抗体作桥的PAG放大法。下面以5-羟色胺定位为例说明这一新方法。
(1)石蜡切片→脱蜡至水。
(2)1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。
(3)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5'×2。
(4)1%EA封闭组织10min。
(5)用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释兔抗5-羟色胺抗体(1:1000)4℃过夜,或者37℃1h。
(6)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5'×2。
(7)1%EA封闭10min。
(8)用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释PAG(1:40),37℃1h。
(9)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10'×2。
(10)1%EA封闭10min。
(11)抗A蛋白抗体(1:100)37℃。45min。
(12)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10'×2。
(13)加0.05mol/l pH7.4 TBS稀释PAG(1:40),37℃45min。
(14)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10'×2。
(15)双蒸水振洗5min。
(16)1%戊二醛10min。
(17)双蒸水振洗5min。
(18)0.01%伊文思蓝2min,甘油封片。
光镜下观察,小肠粘膜内含有嗜银颗粒的细胞胞浆呈红色,阳性颗粒位于细胞核底部,比单纯用PAG染色深度得到加深,阳性结果得到放大。由于抗A蛋白抗体既能通过Fab段又能够通过Fc段与PAG上的A蛋白结合,因此,与其它桥抗体相比它能够在抗原位点处聚集更多的胶体金颗粒。基本原理如下图5-3。
图5-3 PAG放大法原理
PAG放大法的优点:①使用试剂单一;②可大大提高IGS的敏感性,从而使应用IGS方法定位抗原时使用高稀释度的抗体成为可能;③背景干净。可以预见这一新方法将很快受到人们的关注。
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