二、癌胚抗原的免疫细胞化学染色

1．组织加工有人提出用冰冻切片进行CEA免疫细胞化学染色。由于非特异性荧光和需要一定设备条件，有人改用福尔马林固定和胰酶消化的方法。从我们的体会看，福尔马林固定后的切片CEA的部分抗原决定簇被遮盖，阳性结果显着受到影响。但是用冷酒精固定后的组织切片，CEA的阳性率明显升高，而且结果仍很清晰。goldenbery等同时进行CEA酶标记组织，而福尔马林固定的组织切片中CEA检出范围为3.0～7.0ng/g组织，酒精固定的组织切片比福尔马林固定者敏感2～3倍。有趣的是我们用酒精固定26个月的切片进行染色，效果仍然很好。说明冷酒精固定法便于进行回顾性研究。虽然酒精固定后组织收缩比较明显，但不影响组织结构及形态，而且可以进行多种抗原的定位研究，操作简单，是值得推荐的一种组织固定方法。冷酒精固定方法和步骤同抗体产生细胞的研究。

2．染色方法的选择根据实验条件和抗体特点选择染色方法。PAP和ABC技术可以采用，但试剂价格较昂贵，步骤较复杂。我们认为间接荧光或间接酶技术即可获得满意结果。间接酶染色技术步骤如下：

（1）冷酒精固定的组织石蜡包埋，组织切片，常规脱蜡后在PBS中放置5min，过一次蒸馏水清除玻片上的沉淀物后风干，加含3%H₂O₂甲醇一滴在切片上，放置20min后再PBS冲洗3次，过蒸馏水后风干。

（2）加稀释好的兔抗CEA血清（稀释度根据染色工作效价）在37℃湿盒内放置45min。

（3）PBS清洗3次后风干，再加HRP标记物的羊抗兔IgG（稀释度也要根据染色工作效价），37^℃湿盒内放置45min。

（4）PBS清洗3次后加新鲜配制的含3%H₂O₂pH7.6Tris缓冲液（10ml溶液中含二氨基联苯胺5mg）中暗处反应5～8min（边反应边在显微镜下观察），自来水冲洗，用1%甲基绿复染2～5min，再次自来水冲洗，常规脱水、透明和封片，在光镜下观察。

3．阳性结果判断及计数检查前应当对CEA的分布有一定理性认识，而且用正常结肠组织和阳性组织作对照观察。CEA以三种形式出现在胃肠道组织切片中：①腔面分布。沿腺腔面的胞浆有棕红色酶着色。这是胃粘膜中肠上皮化生腺体、高分化腺癌和正常结肠腺体的CEA分布形式。②胞浆分布。在低分化粘液细胞癌中，CEA多位于胞浆。③粘液分布。在高分化腺癌的腺腔和粘液细胞癌周围的粘液中有CEA着色。

4．腹水免疫细胞化学染色临床上鉴别良恶性腹水可采用免疫细胞化学技术。抽取200～300ml腹水，离心后取细胞沉淀进行直接涂片、干燥、酒精固定后采用间接荧光染色。具体的方法是：在腹水涂片上加兔抗CEA抗血清（1：25稀释，稀释液为BPS缓冲液），在37^℃湿盒内放置45min后BPS冲洗，共10min，再加入FITC标记的羊抗兔IgG（1：20稀释，稀释液为0.1%伊文氏蓝缓冲液），在37℃湿盒内放置45min后，PBS冲洗3次，共10min，用50%甘油封片，荧光显微镜观察。有绿色荧光阳性细胞的片子再进行HE染色，做对照观察和判断。也可以将细胞沉淀物在试管内直接进行间接荧光染色（方法同T淋巴细胞染色）。我们发现，不论采用哪种方法，都可能出现非特异性着色。少数淋巴细胞也能出现荧光或酶着色。其机理尚不清楚，如果采用伊文氏蓝作对比荧光染色，可明显减少非特异性荧光，而且淋巴细胞较小，腺癌细胞较大，有利于进行鉴别诊断。