三、地高辛配基随机标记DNA探针法

（一）概述

基因诊断是以核酸分子杂交技术为基础，在核酸水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷和一些传染病病原体的方法。其基本过程是：制备DNA探针，标记探针，检测样本。开展这项工作的关键是要得到高灵敏度、高特异性的探针。以往人们是用放射性同位素来标记探针DNA。近年来，非同位素标记方法发展很快，已有取代同位素标记法的趋势。地高辛配基随机标记DNA探针法，是较为成功的一种非同位素标记方法。其原理是：用化学方法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在dUTP上（Dig-dUTP）。用随机引物及DNA多聚酶，以探针DNA为模板，合成互补DNA，化学修饰过的dUTP同时掺入到标记的DNA探针中。杂交后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针DNA中的Dig-dUTP结合，加入显色底物，在碱性磷酸酶作用下，转变成深棕色或蓝色的化合物。

1．标记　本试剂盒采用随机引物标记方法，可标记少至10ng，多至3μg的DNA。能在新合成的DNA链每20～25个核苷酸，掺入一个Dig-dUTP，反应时间约为1h。

2．杂交　按标准杂交方法进行。可以采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。用过的杂交液可冻存于-20℃，重复使用。

3．免疫学检测　封阻后，检测反应的第一步，抗体结合物与标记DNA结合，出现杂交的半抗原-标记DNA，显色反应起始是在碱性pH条件下加入无色的显色剂X-磷酸盐和NBT，在几分钟内便开始出现蓝色，显色反应的过程持续3d。典型的例子是在24h后终止显色反应。用二甲基甲酰胺洗掉尼龙膜上的颜色后，尼龙膜可重新用于杂交。

4．应用　地高辛配基标记DNA探针及检测试剂盒，能检测0.1pg的同源DNA，能检测1μg哺乳动物DAN中的单拷贝基因，与放射性标记系统比较，此试剂盒能快速得到实验结果（从DNA的标记和杂交至见到检测结果24h内能完成），而且消除了放射性的不安全问题。这试剂的灵敏度与特异性使它适用于所有的杂交技术（包括DNA-印迹转移，菌落杂交，噬菌斑杂交及原位杂交）以替代同位素标记和放射自显影术。

（二）试剂盒成份

1．无标记对照DNA1　此管内有20μl pBR328 DNA100μg/ml,pBR328分别用BamHⅠ,BglⅠtHinfⅠ消化，它们的混合比例为2：3：3，共有16个Pbr328片段，这些片段的大小分别为：4907，2176，1766，1230，1033，653，517，453，298，234，234，220和154×2bp。

2．无标记对照DNA2　此管内有20μl pBR328 DNA200μg/ml，已用EcoRⅠ线性化。

3．DNA稀释缓冲液　有两管，每管1ml[成分为：Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]内含鲑鱼精DNA（50μg/ml）。

4．标记对照DNA　此管内有50μl线性化pBR328DNA，按标记方法已标记有地高辛配基dUTP,含20μg模板DNA，每毫升含5μg合成的标记DNA。

5．六聚核苷酸混合物

6．标记用混合底物　此管内有50μl10倍浓度的dNTP标记用混合底物，含dATP（1mmol/L）dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)。

7．DNA聚合酶Ⅰ大片段（标记级）　此管内有25μl DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow），2^U/μl。

8．（Dig）AP结合物　此管内有200μl多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，结合有碱性磷酸酶750U/ml。

9．NBT　有两管，每管1.25ml，是溶于70%（V/V）二甲基甲酰胺的硝基蓝四唑盐溶液（75mg/ml）。

10．X-磷酸盐　有两管，每管0.9ml，是溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐的甲苯胺溶液（50mg/ml）。

11．封阻试剂　有两瓶，每瓶有50g粉剂。

（三）需配制的溶液

EDTA（0.2mol/L）,pH8.0(20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇；Tris-HCl(10mmol/L);ED－TA(1mmol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸钠盐；10%（V/V）SDS；20×SSC：3mol/l NaCl;0.3mol/L柠檬酸三钠；pH7.0Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5Tris–HCl(100mmol/L);NaCl(100mmol/L);MgCl2(50mmol/L)pH9.5(20℃)。

（四）操作方法

1．标记DNA探针　每次标准的反应可标记10ng至3μg线性的DNA，也可标记更大量的DNA，但所有的成分和体积要相应增加。

（1）DNA探针热变性，煮沸10min，迅速冷却于冰/乙醇中5min以上，待用。

（2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及试剂：

新鲜变性的DNA 1-3μg

六聚核苷酸混合物 2μl（管5）

dNTP标记用混合底物 　2μl（管6）

加无菌重蒸水至　 19μl

DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）　1μl（管7）

（3）在37℃保温至少60min，可到20h。

（4）煮沸5min，终止反应。

（5）15000rpm离心30s，置于冰上待用。

2．预杂交　按100cm²膜用20～40ml预杂交溶液，预杂交时使溶液处于流动状态。

预杂交液组成：5×SSC

0.5%（W/V）封阻试剂（管11）

0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠

0.02%（W/V）SDS

膜放入塑料袋，灌入预杂交液，排除气体后密封，在65℃预杂交过夜。

3．杂交　按100cm2膜用2.5ml杂交液，杂交时偶尔摇动杂交袋，使里面的溶液重新分配。

杂交液组成： 50%甲酰胺（V/V）

5%（W/V）封阻试剂

5×SSC

0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠

0．02%(W/V)SDS

新变性标记DNA（150ng/ml）

杂交液取代预杂交液，替换间膜不能干，成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜（16～20h）。

4．洗膜按100cm²膜用250ml洗膜液计算。

（1）在室温下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。

（2）在65℃条件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。

（3）在室温下用2×SSC溶液漂洗1次。

5．免疫测定

（1）配制溶液

缓冲液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃）

缓冲液2：0.5%(W/V)封阻试剂(管11),配制于缓冲液1中(封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50～70℃,此溶液保持混浊)。

缓冲液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI₂(500mmol/L)pH9.5(20℃)。

缓冲液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)

显色溶液：新鲜配制，在10ml缓冲液3中，加45μlNBT溶液（管9）和35μlX-磷酸盐缓冲液（管10）。

2． 显色过程

A．膜在缓冲液1中短暂洗涤（1min）。

B．在100ml缓冲2中保温30min。

C．再用缓冲液1短暂洗涤。

D.用缓冲液1稀释的抗体结合物(管8)至150^U/L(1:5000);稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12h。

E.膜在20ml稀释的抗体结合物溶液中保温30min。

F.用100ml缓冲液1洗膜,以除去未结合的抗体结合物,15min,2次。

G.膜在缓冲液3中平衡2min。

H.在黑暗条件下,膜与10ml显色溶液放入塑料袋内密封或放入合适的盒子内,几分钟内开始出现颜色,一般显色反应在1天后全部完成。当颜色显影时，不可振荡或搅拌。

I．当要求的点或带已被检测时，可用50ml缓冲液4洗膜5min终止反应。

J．摄相。

说明：上述各反应均在室温下进行，除了显色反应外，均需振荡或搅拌。

（五）排除实验中问题的方法

1．DNA不能有效地被标记时考虑

（1）用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新纯化DNA。

（2）标记反应的保温时间延长（增至20h）。

（3）DNA变性或许不完全，这时对大片段DNA特别重要。

2．不能达到预期的灵敏度时考虑

（1）DNA标记率。

（2）增加标记DNA的浓度或增加杂交时间。

（3）显色反应的时间可延长至3d。

3．若显色时背景过深，可采取

（1）在杂交溶液中减少标记DNA量。

（2）增加杂交溶液的体积，使膜随意漂浮在溶液中。

（3）某些类型的尼龙膜可能产生深色背景，因此可采用其它类型的尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。

（4）在杂交和检测过程中增加封阻试剂的浓度。