（二）F/P比值的测定

F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求F/P的克分子比值为1～2。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，降低敏感性。

1．蛋白质定量 测定荧光抗体的蛋白质mg/ml量。

2．结合荧光素定量 　先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取FITC1mg,溶于10ml 0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液中，再用0.01mol/l pH7.2PBS稀释到100ml，此时荧光素含量为10 μg/ml，以此为原液，再倍比稀释9个不同浓度的溶液，用分光亮度计在490nm波长测定光密度值（OD），以光密度为纵坐标，荧光素含量为横坐标，作标准函数图。

荧光素与蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向位移约5nm,FITC和蛋白质结合后由490nm变为493～495nm，RB200和蛋白质结合后变为595nm。

F/P比值的计算：可按以下公式计算。

式中160000为抗体蛋白质的分子量，390为FITC的分子量。蛋白质从克换算为毫克需再乘以103，而荧光素从克换算为微克需要再乘以106。

测定RB200荧光抗体的克分子比值公式如下：

按图3-4测定法更为简便，即先用276nm波长测得蛋白质的OD值，再用493波长测得FITC的OD值，将这两个OD值在图3-14上连成一直线，直线与各纵线交叉处，即可查出标记抗体的以下数值：FITc μg/ml ，F/P 的μg/mg,F/P的克分子比值，蛋白mg/ml等。

图3-14　FITC标记物中球蛋白、荧光色素和E/P比值计算图