五、真核细胞基因组DNA的制备

从不同组织细胞或血细胞中提取DNA是进行基因诊断的先决条件。制备DNA的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K的应用使这两个原则得到了保证。在提取DNA的反应体系中，SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：（1）溶解膜蛋白而不破坏细胞膜；（2）解聚细胞中的核蛋白；（3）与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来。蛋白酶K可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸，使DNA分子尽量完整地分离出来。具体方法如下：

（一）白细胞DNA的制备

（1）采集外周静脉血10ml，加1.7ml ACD（柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm²灭菌30min）抗凝。

（2）将血液放入已灭菌的50ml塑料离心管内，加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、10mmol/lTris-HCl(pH7.5)、5mmol/L MgCl₂、1%Triton –X 100]，轻轻上下振荡至透明，红细胞完全溶解。

（3）冰浴10min，离心，3000rpm，10min。弃上清，STMT重复处理1～3次。

（4）弃上清，白色沉淀物加10mlSTE[0.1mol/L NaCl、10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)]，先少量，充分混匀，然后加10mg/ml蛋白酶K100μl，20%SDS30μl，摇匀，置37℃水浴15～20h。

（5）用等体积饱和酚抽提，3000rpm离心5min。

（6）用大口钝缘吸管小心吸取上层水相，加饱和酚和氯仿-异戊醇（24：1）抽提，3000rpm离心5min 。

（7）小心吸取上层水相，用等体积氯仿-异戊醇（24：1），抽提，3000rpm离心5min。

（8）小心吸取上层水相，加入1/10体积3mol/l NaAc,2.5体积预冷无水乙醇混匀，-20℃过夜。

（9）将白色絮状沉淀物用玻璃棒挑出，放入Eppendorf管内，加1ml 75%乙醇4℃静置1h，离心，10000rpm10min。

（10）弃上清，用蜡膜将管口封好，针刺数个小孔，真空抽提（10～15min）。

（11）加200μl1×TE溶解，置4℃保存。

（12）对所提DNA用紫外分光光度计进行定量和纯度检测。

（13）取2～4μl DNA样品，经琼脂糖凝胶（Agarose）电泳，检查所提DNA的质量及降解情况。

（二）组织DNA的制备

（1）将200mg组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎，加4ml 1×RSB缓冲液（10mmol/L Tris, pH7.4;10mmol/lNaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4）放入10ml带盖的塑料管中。

（2）加SDS至浓度为1%（可加0.4ml10%SDS），混匀。由于DNA从核中释放出来，样品变得粘稠。

（3）加10mg/ml蛋白酶k 44μl，终浓度为100μl/ml，37℃保温1～3d，直到组织完全解体。中间可振动样品管几次。加0.4ml 5mol/L NaCl。

（4）用等体积饱和酚、1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿-异戊醇及等体积氯仿-异戊醇（24：1）各抽提一次，3000rpm离心5min，用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。

（5）加2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA。用一玻璃棒收集白色纤维丝状的大片段DNA，并移入一新管，吸干DNA中的无水乙醇。

（6）DNA溶于4ml 0.1×SSC中，4℃过夜可作进一步纯化。

（7）加20μlRNase A(10mg/ml),37 ℃保温5h。加0.4ml5mol/L NaCl。

（8）同上法用饱和酚、氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀离心，弃上清。

（9）75%乙醇洗涤2次，离心，弃上清，真空抽干。适量1×TE溶解，保存在4℃。