二、缓冲液

《实用免疫细胞与核酸》书籍目录

免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多,即使是同种缓冲液,其浓度、pH、离子强度等也常常不同。在此介绍几种最常用的缓冲液的配制。

1.0.2mol/L(pH7.4)磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffer, PB)

试剂: NaH2PO4·2H2O

Na2HPO4·12H2O

配制方法:配制时,常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4,两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(PB),根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。

(1)0.2mol/L的 Na2HPO4;称取Na2HPO4.12H2o 31.2g(或 NaH2PO4·H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。

(2)0.2mol/L的 Na2HPO4:称取NaHPO4.·12H2o 71.632g(或 Na2HPO4·7H2O 53.6g或 Na2HPO4·2H2o 35.6g)加重蒸水至1000ml溶解。

(3)0.2mol/LpH7.4的PB的配制:取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的 Na2HPO4·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PB(pH约为7.4~7.5)。若pH偏高或偏低,可通过改变二者的比例来加以调整,室温保存即可。

2.0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PhosphateBuffered Saline, PBS)

试剂:0.2mol/L PB 50ml

NaCl  8.5~9g(约0.15mol/L)

重蒸水 至1000ml

配制方法:称取NaCl 8.5~9g及0.2mol/L的PB 50ml,加入1000ml的容量瓶中,最后加重蒸水至1000ml,充分摇匀即可。若拟配制0.02mol/L的PBS,则PB量加倍即可,依此类推。

PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液,0.01mol/L的PBS主要用于漂洗组织标本、稀释血清等,其pH应在7.25~7.35之间,否则需要调整。0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情况下,0.2mol/l PB的pH值稍高些,稀释成0.01mol/L的PBS时,常可达到要求的pH值,若需调整pH,通常也是调PB的pH。

3.Karasson –Schwlt’s磷酸盐缓冲液

试剂: NaH2PO4·H2O3.31g

Na2HPO4·7H2O 33.77g

重蒸水 至1000ml

配制方法:同前

该缓冲液主要用于配制Zamboni’s固定液。

4.0.5mol/L pH7.6的Tris- HCl缓冲液。

试剂:Tris(三羟甲基氨基甲烷)60.57g

1N HCl 约420ml

重蒸水 至1000ml

配制方法:先以少量重蒸水(300~500ml)溶解Tris,加入HCl后,用1N的HCl或1N的NaOH将pH调至7.6,最后加重蒸水至1000ml。此液为储备液,于4℃冰箱中保存。免疫细胞化学中常用的Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L,用时取储备液稀释10倍即可。

该液主要用于配制Tris缓冲生理盐水(TBS)、DAB显色液。

5.Tris缓冲生理盐水(TrisBuffered,Saline,TBS)

试剂:0.5mol/L Tris-HCl缓冲液 100ml

NaCl 3.5~9g(0.15mol/L)

重蒸水至1000ml

配制:先以重蒸水少许溶解NaCl,再加Tris-HCl缓冲液,最后加重蒸水至1000ml,充分摇匀使Tris终浓度为0.05mol/L。

TBS主要用于漂洗标本,常用于免疫酶技术中。

6.Tris-TBS(PBS)

试剂:Triton X-100 10ml(1%)或3ml(0.3%)

0.5mol/L Tris缓冲液(pH7.6)1000ml(50ml)或(0.2mol/L的PB)

NaCl8.5~9g

重蒸水 至1000ml

配制方法:先以重蒸水少许溶解NaCl后,加入Triton X-100及Tris缓冲液或(PB),最后加重蒸水至1000ml,充分摇匀。

该液常用浓度为1%及0.3%,前者主要用于漂洗标本,后者主要用于稀释血清。

7.0.1mol/L(pH7.4)二甲胂酸缓冲液

试剂:0.2mol/L二甲胂酸钠500ml

0.1N HCl28ml

蒸馏水 至1000ml

配制方法:先称取二甲胂酸钠(MW:214)42.8g,加蒸馏水至1000ml,使0.2mol/L的二甲胂酸钠溶液;再取HCl 1.7ml加蒸馏水至1000ml ,配成0.1N,最后 取0.2mol/L二甲胂酸钠溶液500ml及0.1n HCl 28ml混合,加蒸馏水至1000ml,即为0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液。

8.几种常用的不同pH值缓冲液的配制表

(1)0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.7~8.0)

pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2HPO4(ml)
5.793.56.5
5.892.08.0
5.990.010.0
6.087.712.3
6.185.015.0
6.281.518.5
6.377.522.5
6.473.526.5
6.568.531.5
6.662.537.5
6.756.543.5
6.851.049.0
6.945.055.0
7.039.061.0
7.133.067.0
7.228.072.0
7.323.067.0
7.419.081.0
7.516.084.0
7.613.087.0
7.710.589.5
7.88.591.5
7.97.093.0
8.05.394.7

(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.19~9.10)

pH0.2mol/L Tris(ml)0.2mol/L HCl(ml)H2O
7.1910.018.012.0
7.3610.017.013.0
7.5410.016.014.0
7.6610.014.015.0
7.7710.014.016.0
7.8710.013.017.0
7.9610.012.018.0
8.0510.011.019.0
8.1410.010.020.0
8.2310.09.021.0
8.3210.08.022.0
8.4110.07.023.0
8.5110.06.024.0
8.6210.05.025.0
8.7410.04.026.0
8.9210.03.027.0
9.1010.02.028.0

(3)0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH3.6~5.6)

pH0.2mol/L醋酸(ml)0.2mol/L醋酸钠(ml)
3.646.33.7
3.844.06.0
4.041.09.0
4.236.813.2
4.430.519.5
4.625.524.5
4.820.030.0
5.014.835.2
5.210.539.5
5.48.841.2
5.64.845.2

(4)0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH5.0~7.4)

pH0.2mol/L二甲胂酸钠(ml)0.2N HCl(ml)蒸馏水
5.02523.551.5
5.22522.552.5
5.42521.553.5
5.62519.655.5
5.82517.457.5
6.02514.860.3
6.22511.963.1
6.4259.265.8
6.6256.768.3
6.8254.770.3
7.0253.271.8
7.2252.172.9
7.4251.473.6

注:HCI可由NCO3代替,配制成二甲胂酸钠-HNO3缓冲液。

(5)0.2mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.2~10.7)

pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3(ml)
9.24.046.0
9.37.542.5
9.49.540.5
9.513.037.0
9.616.034.0
9.719.530.5
9.822.028.0
9.925.025.0
10.027.522.5
10.130.020.0
10.233.017.0
10.335.514.5
10.438.511.5
10.540.59.5
10.642.57.5
10.745.05.0

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