【岐黄之术】 > 中医杂集 > 《实用免疫细胞与核酸》

一、PCR操作范例

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《实用免疫细胞与核酸》书籍目录

在一个典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg2+和两个合成的DNA引物。模板DNa 94℃变性1min，引物与模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3～5min；在末次循环后，样品仍需继续延伸3～5min以上，确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成，加入量和反应条件，使人们以此为基础，对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件，特列举Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA试剂盒提供的典型反应条件供参考。

表22-1 PCR反应混合液

成分加入体积（μl）最终浓度
双蒸馏水53.5　
10×反应缓冲液[1]10.0[1×]Mg2+1.5mmol/l K+50mmol/L
4×dNTPs(各1.25mmol/L)16.0各200μmol/L
λ-DNA模板（全长48.5kD）10.01ng/次
引物1,2（各25bp,20μmol/L）[3,4]5.01.0μmol/L（100pmol）
Taq聚合酶储存液[2]0.52U/100μl
总体积（pH8.3）100.0　
石蜡油50～100.0　

扩增条件：94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25～30个循环。

注：[1]反应缓冲液[10×]含：100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),

15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2,

0.01%(W/V)明胶（Sigma G2500）

[2]酶储存缓冲液（-20℃）含：50%甘油，100mmol/l KCl,

20mmol/L Tris-HCl ph8.0

0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT

200μg/ml明胶

0.5%吐温20，0.5% Nonidet P40

[3][4]引物，1，2：扩增λ-噬菌体基因中500bp的片段

引物1序列：7131～7155（5’）-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)

引物2序列：7606～7630（5’）-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)

注意（3’）端有2个bp互补故易生成50bp的双体

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  1. PCR操作范例《实用免疫细胞与核酸》
  2. PCR标本的制备《基因诊断与性传播疾病》
  3. PCR的基本原理和基本程序《基因诊断与性传播疾病》
  4. PCR-SSCP分析技术《实用免疫细胞与核酸》
  5. PCR的特点《基因诊断与性传播疾病》
  6. PCO2、H+和PO2在影响呼吸中的相互作用《生理学》
  7. PCR法《生物化学与分子生物学》
  8. Parry-Romberg氏综合征《神经精神疾病诊断学》
  9. PCR反应的基本条件及其对PCR的影响《基因诊断与性传播疾病》
  10. Parinaud氏综合征《神经精神疾病诊断学》
  11. PCR方法《基因诊断与性传播疾病》
  12. PAP免疫电镜双重标记《实用免疫细胞与核酸》
  13. PCR缓冲液《实用免疫细胞与核酸》
  14. PAP法《实用免疫细胞与核酸》
  15. PCR技术的原理《实用免疫细胞与核酸》
  16. PAP包埋前染色法（Pickel 等，1975）《实用免疫细胞与核酸》
  17. PCR介导的信号转导途径《细胞和分子免疫学》
  18. PAP包埋后染色法《实用免疫细胞与核酸》
  19. PCR扩增产物的分析法《基因诊断与性传播疾病》
  20. PaO[XB]2[/XB]下降而Paco[XB]2[/XB]变动不大《病理生理学》
  21. PCR实验中常见问题对策《基因诊断与性传播疾病》
  22. PaO[XB]2[/XB]下降PaCO[XB]2[/XB]上升，二者成一定比例关系《病理生理学》
  23. PCR仪器的发展《实用免疫细胞与核酸》
  24. Pao[XB]2[/XB]下降，Paco[XB]2[/XB]也明显下降《病理生理学》
  25. PCR应用领域《实用免疫细胞与核酸》
  26. PaO[XB]2[/XB]下降，Paco[XB]2[/XB]升高，二者变化不成一定比例关系《病理生理学》
  27. PCR应用特点《实用免疫细胞与核酸》
  28. p59[SB]fyn[/SB]的《细胞和分子免疫学》
  29. PCR与原位杂交细胞化学结合法《实用免疫细胞与核酸》
  30. p56[SB]lck[/SB]《细胞和分子免疫学》
  31. PE、社会药学与医院药学的关系《医院药学》

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