四、HRP标记凝集素及凝集素抗体的制备

1．HRP标记凝集素法 适用于小量的凝集素标记（Ponder 1983）。

（1）HRP的活化

①将10mg HRP(SigmaType VI)溶解在1ml 0.3mol/L 的重碳酸钠溶液中（1.25g/50ml）。

②加50μl含1%氟二硝基苯的无水乙醇溶液，室温轻度搅拌1h。

③加1ml含0.06mol/L的过碘酸钠的蒸馏水（0.62g/50ml），室温下轻度搅拌30min。

④在室温下加两滴0.16mol/L乙二醇，轻搅1h。

⑤用Sephadex G—25装成小柱，用0.3mol/L的重碳酸钠溶液，使含HRP的混合液过柱。

（2）结合

①正常条件下，可用凝集素及过氧化物酶各半量，但其比例可根据需要调整，以10mg凝集素溶解在25ml的重碳酸盐缓冲液里，加到“活化”的HRP中去 ，这样得出的凝集素浓度大约是0.3mg/ml，可加进0.1mol/L相应的特异的糖，以保护凝集素结合时的结合部位。糖在下步透析或层析时去掉。

②在室温下轻搅拌，结合3h。

③加入1mg硼氢化钠，室温下作用1h以稳定结合物活性。

④用1N HCl调整pH至6.4，留置室温下过夜。

（3）纯化

①用适当的凝胶层析柱如SephadexG—200、Saphacryl—300层析法将游离的凝集素、游离的过氧化物酶和高分子量的成分从结合物分离出去，包括抑制性的糖也在此时分离出去。

②提纯后的结合物在280nm和403nm波长处测量其吸光率。用1%BSA先通过0.22μm的微孔过滤器，以确定被结合的凝集素是否被吸附在滤器中，然后上述结合物经过该微孔滤过器过滤到一个无菌瓶中。

③加入叠氮钠，浓度1：1000，保存于4℃C备用。

2．抗凝集素抗体的制备 　抗凝集素抗体的制备法与一般免疫血清制备大致相同（见第二章　）。所不同的是：①凝集素具有较强的毒性，易使被免疫动物发病或甚至死亡。解决的方法是经处理使凝集素变性，从而减低其毒性，但同时要保证其抗原性不受或少受破坏。②要设法阻断凝集素的糖结合部位，以减少对这些部位的抗体的产生，解决的办法是预先以相应的糖阻断这些结合部位。Leathem 和Atkin（1982）设计了一个办法，他们首先应用琼脂糖（Sepharose）珠，珠上有一系列共价糖的附着，这些糖可阻断凝集素结合部位，这种糖珠有商品供应（Sigma LtD），每1ml糖珠能结合大约12mg凝集素。其次用加入福尔马林和加热的方法使凝集素变性，毒性减低而不影响抗原性。具体操作如下：

①1ml琼脂糖—半乳糖珠与1mg花生凝集素相结合，室温1h。

②加入10ml 10%福尔马林，在水浴中加热到60℃，1h。

③用盐水离心洗珠，将珠分成以10μl为单位的若干小份，保存在-20℃。

④皮下多处注射两只家兔背部，每次注射100μl，每隔三周注射一次。取血40～50ml，保存在-20℃备用。