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【岐黄之术】

2．包埋前染色

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（1）组织经过适当固定，为增强细胞穿透性，可在固定液中加入皂角素（Saponin），使其浓度为0.01%，经含皂角认固定剂处理5～8min后，应用0.01mol/l PBS Ph7.4冲洗12h左右，中间换洗3～4次。

（2）组织切片贴于明胶涂抹的坡片上，细胞可制成混悬液，用离心法操作或制成涂片。

（3）0.05mol/l PBS pH7.4洗3min。

（4）以1：5正常羊血清处理切片30min室温，以阻断非特异性吸附。

（5）第一抗体4℃孵育20h后室温2h或过夜。

（6）0.05mol/l TBS pH7.4洗3min×3。

（7）0.02mol/l TBS pH8.2洗3min×3，为与胶体金结合作准备。

（8）再次阻断非特异性吸附，同（4）。

（9）以金标记的第二抗体（工作浓度1：40左右）在室温下孵育1h。

（10）0.05mol/l TBS pH8.2洗3min。

（11）0.05mol/l TBS pH7.4洗3min×3

（12）1%锇酸（0.1mol/l PBS溶液）1h。

（13）双蒸水洗15min。

（14）系列酒精或丙酮脱水，包埋、超薄切片。（15）枸椽酸铅对照染色。

为增加抗非特异性染色，有的实验室倾向在TBS中加入1%小牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA, Sigma）。理想的免疫金染色切片，背景应清洁，无残留的金或其他无机盐颗粒，金粒集中在抗原、抗体反应部位。要获得理想的免疫金染色切片，需注意的因素很多，其中主要的如：①抗体血清的高度特异性和亲和力；②被检组织应有较高浓度的抗原；③冲洗液的清洁度，冲洗的彻底程度以及整个过程中应用的各种器皿的清洁度等；④所有溶液最好用微孔滤过器（milipore filter滤过），滤膜孔径0.2～0.45μm，所有器皿应清洁和专用。整个操作过程应在湿盒内进行，以使载网保持湿润。

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