（二）人工微小染色体

包括人体在内的高等生物基因工程中遇到的一个难题是缺乏合适的基因载体。要求载体对受体细胞没有危害，能安全、稳定地转给后代，使基因的性状得到连续的表达。这对校正某种遗传缺陷或改进某种性状都是十分有用的。目前一些实验室正致力于构建人工微小染色体（microchromosome）。

构建染色体应包括：基因、复制起点、着丝粒和端粒。染色体上需带有基因是不言而喻的。复制起点是染色体复制所不可缺少的。着丝粒保证复制后的染色体均等地分配到两个子细胞中。端粒具有某种特定结构以保证染色体的个体性。

首先，构建的是酵母的人工微小染色体。天然的酵母染色体为150～1000kb。人工构建的微小染色体长55kb，在细胞内很稳定，只是每个细胞里的拷贝数很少。比如已构成的人工微小染色体为7～15kb，每个细胞里的拷贝数虽然增多，但不够稳定。

人工构建酵母微小染色体的具体步骤见图23-6。从图中可以看到，先用质粒pBR322为材料，连接酵母的标记基因Leu2（亮氨酸）后去转化大肠杆菌，然后再接上酵母染色体上分离得到的着丝粒CEN3，再去转化大肠杆菌以增殖重组质粒，取得下一步实验用的DNA。接下去是连接从酵母（真核生物）中分离得到的ARS1。ARS是指自主复制顺序（autonomouslyreplicat－ing sequence），这个顺序中可能包含着复制起点。目前已从非洲爪蟾的线粒DNA，衣藻和烟草叶绿体和核DNA中分离ARS。最后一个步骤是接上染色体端粒。用的是四膜虫（Te－trahymena）的rDNA末端（Tr末端）。这样构建成的质粒去转化酵母细胞后，在细胞内断开成为线状重组DNA分子，可以象天然染色体一样地复制和分离，这就是酵母线状质粒YLp4。

图23-6　构建酵母人工微小染色体的步骤