二、间接法
1.检查抗体法(夹心法)此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应,再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合,抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间,故称夹心法。
2.检查抗体法用已知抗原细胞或组织标本的切片,加上待检血清,如果其中含有切片中某种抗原的抗体,抗体便沉淀结合在抗原上,再用间接荧光抗体(抗种属特异性IgG荧光抗体)与结合在抗原上的抗体反应(如检测人血清中的抗体必需用抗人IgG荧光抗体等),在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段(图3-3)
图3-3 间接法
3.检查抗原法双薄片此法是直接法的重要改进,先用特异性(对细胞或组织内抗原)抗体(或称第一抗体)与细胞标本反应,随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体,再用间接荧光抗体(也称第二抗体,种特异性)与结合在抗原上的抗体(是第二抗体的抗原)结合,形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗全显著多于直接法,从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3~5个分子抗体,当此抗体作为抗原时又可结合3~5分子的荧光抗体,所以和直接法相比荧光亮度可增强3至4倍。此法除灵敏性高外,它只需要制备一种种属间接荧光抗体,可以适用于多种第一抗体的标记显示。这是现在最广泛应用的技术。
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