四、免疫电镜金—银法染色技术
关于免疫金银细胞化学的原理、试剂配制和光镜显示技术在本书第五章 已作了较详尽的叙述。免疫金银细胞化学技术说可应用于电镜水平。一般用于包埋前染色。其主要操作步骤如下:
(1)组织固定振动切片机切片10~30μm。
(2)人3%正常羊血清,含0.1%Triton X—100 的PBS孵育30min,以封闭非特异性结合部位
(3)1%硼氢化钠的PBS孵育30min。
(4)一抗37℃,2h。
(5)PBS含0.1%BSA pH7.4 冲洗3min×3次。
(6)PBS含0.1%BSA pH8.2 冲洗3min×3次。
(7)人10~15nm金标羊抗兔抗血清,工作浓度约1:10,37℃孵育45min。
(8)硝酸银液物理显影(详见第五章 第六节 )。
(9)在解剖显微镜下取免疫反应阳性部位,人1%锇酸后固定20min,常规脱水,树脂包埋。
(10)超薄切片机切0.1μm左右半薄切片,定位阳性反应部位,制超薄切片。如有暗视野微镜则更有助于定位。在暗视野前景下,金银粒呈金黄色闪光颗粒,即使微量金银也可定位,微镜则更有助于定位。在暗视野前景下,金银粒呈金黄色闪光颗粒,即使微量金银也可定位。
(11)铀—铅电镜染色,电镜观察。
免疫金银法敏感度高,金银颗粒电子密度高,反差强;应用包埋前染色可先定位阳性反应部位再作电镜超薄切片,获得阳性反应机率高,特别适用于含微量抗原的部位,如突触等。其不足是须经暗室显影,手续较烦杂,包埋前免疫染色易增加非特异性染色。另外,由于单个金粒周围结合的银粒不是固定的,受多种因素影响。因此,电镜免疫金粒染色法的金粒银粒计算不适于做半定量观察,误差较大。
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