二、溶菌酶的免疫细胞化学染色特点

1．组织固定和加工用冰冻组织切片可直接进行溶菌酶免疫细胞化学研究。用冷酒精固定，4%福尔马林缓冲液或1.5%戊二醛固定均能进行免疫细胞化学染色。但浸蜡时温度不能超过60^℃，载玻片应涂薄层明胶以防组织切片脱落。载片后，组织切片应放在50～56^℃的烤箱中干燥但不能放在底层，因烤箱底层温度不均匀。组织切片应避免接触含油类的手和容器。组织块应放在4℃密闭容器内干燥保存。脱蜡一定要完全。

2．染色方法的选择根据具备的抗体和标记抗体，免疫荧光和免疫酶技术均可采用。间接法、PAP法和ABC等方法均可以选择。大部分报道多采用冷冻切片和ABC染色方法。ABC方法特异性强，敏感性高，非特异性染色少。目前国内已有ABC试剂盒生产。普遍认为国外Vectastain 实验室生产的Vectastain Elite ABC kit试剂盒较好，其敏感性比Vectastain ABC peroxidase kit高5倍。如果加大第一个抗体的浓度，可进行快速染色，整个染色过程只需30min。如果要进行双标记染色，可在DAB显色液作用后组织切片再进行另一种抗体染色，最后在DAB显色液中加氯化镍，使阳性部位显示紫色。与DAB显示红棕色比较，反差明显。

3．ABC染色步骤叠氮钠能抑制过氧化酶活性，不宜用以稀释ABC试剂盒中的试剂。第一抗体应用0.1%结晶状的牛血清白蛋白溶液稀释。所用缓冲液最好新鲜配制，ABC试剂用玻璃瓶装的蒸馏水稀释，去离子水可能含过氧化酶抑制剂，能降低敏感性，不宜采用。具体步骤是：①新鲜组织冰冻切片后空气干燥或风干10min。②切片用丙酮或95%酒精固定10min后PBS冲洗3次，共10min。（也可先固定，后切片，再清洗）。③在0.3%H₂O₂甲醇中放置20min后PBS冲洗3次，每次5min。④用正常兔血清稀释孵育20min后，用滤纸吸取过多的血清，并擦干载片中组织周围的液体，但不能使组织干燥，并用彩色笔在组织周围圈画以防抗体液流失。⑤加鼠抗溶菌酶稀释抗血清，在室温下放置30min或在4^℃过夜后BPS洗10min。⑥加生物素化的兔抗鼠血清稀释液，在室温下放置30min后PBS洗20min。⑦加稀释好的Vec-tastain Elite ABC试剂盒中的AB混合液（在使用前30min配好），再孵育30min，PBS洗10min。⑧组织切片在含0.1%DAB（1mg/ml）和0.02%H₂O₂的0.1mol/l pH7.6 Tris缓冲液中反应2～7min，自来水冲洗5min（在显微镜下观察结果，决定反应时间）后甲基绿或苏木精对比染色，脱水和封片，显微镜观察。

4．结果判断溶菌酶主要分布在腺体细胞胞浆内，其中以潘氏细胞和杯状细胞中最明显，也可以分布在腔面或粘液中。炎性组织中粒性白细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润较多，也有明显着色。但是这些细胞多位于固有层内，即使个别细胞位于上皮层，其形态与腺体细胞不同，容易鉴别。当然，这些阳性细胞需与内源酶引起的着色相鉴别。