十二、用聚合酶链反应标记高活性DNA探针
聚合酶链反应(PCR)或称体外基因倍增技术,它利用一对位于待扩增的DNA序列两端的取向相对的DNA引物,在DNA聚合酶的介导下,经过多次变性,退火和延伸过程的重复性循环,大量合成靶DNA序列。在标记dNTP存在时,经PCR反应产生的靶DNA片段均参入了标记物,用此法标记的探针标记率高达97.4%。此法重复性好,简便、快速、特异、不要求模板DNA的纯度,可以大量制备。此法有普遍应用价值。
标记方法如下:待标DNA模板1ng,50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.4),2.5mmol/LMgCl2dATP、dCTP、dGTP各200μmol/l dTTP150μmol/Ll,Bio-11-dUTP 50μmol./L, 引物各1μmol/L,明胶200μg/ml,2u Taq DAN聚合酶,总反应体积为100μl。混匀后,加石蜡油封顶,94℃和55℃各2min,72℃3min,经25个循环后,可产生5~10μg标记探针,需时仅4h。乙醇沉淀扩增的产物后,溶于100μl TE中,分装-20℃。
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