三、肝癌免疫细胞化学

原发性肝细胞癌（简称肝癌）是世界上较常见的恶性肿瘤之一，特别在非洲和亚洲一些地区肝癌发病率较高。自从发现乙型肝炎抗原（HBAg）以来，给HBV与肝癌发病关系的研究开辟了新的途径。近年来用免疫细胞化学技术及分子杂交技术对HBV与肝癌发病关系的研究更加深入和广泛，并取得一定成果。全世界各地通过大量的流行病学、免疫病理学、分子遗传学等研究结果表明，HBV感染与肝癌的发病有密切关系，普遍认为HBV是肝癌发病的主要原因。目前尚不完全清楚HBV致癌机理，是具有直接致癌作用或间接致癌作用，这有待进一步研究。

（一）HBV与原发性肝癌的流行病学证据

HBV与原发性肝癌关系的研究已有20余年，目前对HBV作为肝癌病因的证据日益增多，特别是对HBV的分子生物学的研究表明，HBV可能具有直接致癌作用。如下事实可作为临床学和流行病学的证据：

（1）原发性肝癌常发生在HBV流行区，而非流行区则发病率很低。

（2）血清学研究表明：生活在HBV流行区的肝癌病人50%～90%HBsAg阳性，而对照组仅为5%～15%；抗-HBc为80%～90%，而对照组为15%～35%。近年来研究表明，肝癌病人抗-GBx的检出率在85%左右。而对照组很低。些标志物被认为是目前正在发生HBV感染或先前有HBV持续感染的证据。甚至在欧美肝癌发病率很低的国家，肝癌病人HBsAg，抗-HBc和抗-HBx检出率也明显比对照组高。从大量的研究结果表明，在HBV流行区HBV携带者肝癌发病的相对危险性比非携带者高十倍，甚至几百倍。

（3）在HBV流行的人群中，HBV携带者与肝癌家庭聚集性的早期观察，生活早期婴儿从母亲传播感染是HBV慢性携带者，后代亦易成为慢性携带者。Larouze 等发现塞内加尔患肝癌的母亲中71%HBsAg阳性，而相应的对照组仅为13%，在朝鲜和我国台湾省也观察到同样的现象。预防母-婴的HBV传播，对预防肝癌的发生具有重要意义，从研究家族病例来看，大多数最终发生肝癌的个体在出生时或是出生后第一年内从携带HBV的母亲或兄弟姐妹间获得感染。

（4）约80%的肝癌病例发生在肝硬变或慢性活动性肝炎的基础上，而肝硬变和慢性活动性肝炎双往往由HBV慢性持续性感染引起的。在亚洲和非洲一些地区，肝硬变病人90%以上HBsAg阳性，慢性活动性肝炎病人75%以上HBsAg阳性，而对照组只有6%～14%HBsAg阳性。

（二）肝硬变与肝癌的关系

大多数肝癌病合并有肝硬变，部分肝硬变病人可发展为肝癌，这一事实早已被人们所注意。大多数报道肝癌合并肝硬变为80%～90%。肝癌合并肝硬变的类型主要为坏死后大结节　型肝硬变，约占70%～80%，少数为混合型，合并小结节　型肝硬变少见。肝硬变发展为肝癌的百分率，各报道差别较大，但大多数报道为20%左右。坏死后大结节　型肝硬变与乙型肝炎病毒感染有密切关系，HBsAg阳性率很高，达70%～80%。Blumberg等（1977）报道在84例肝硬变中有24例HBsAg阳性，其中6例（25%）发展成肝癌。Obata(1980)指出，HBsAg阳性的肝硬变有23%发生癌变，Nayak（1977）报道，肝硬变发生癌变的机会和其HBsAg阳性有关，HBsAg阳性的肝硬变发生肝癌的机会为51%，而与HBsAg阳性的大结节　型肝硬变有密切关系。大结节　型肝硬变常伴有肝细胞的不典型增生，而伴有不典型增生的肝硬变HBsAg阳性检出率很高，表明肝细胞不典型增生与HBsAg慢性持续感染有密切关系。有人认为不典型增生的肝细胞是一种癌前期病变。

（三）肝细胞肝癌及癌周肝组织内HBV抗原的分布

目前用组织化学、免疫组织化学及免疫电镜等技术可以在人肝癌及癌旁肝细胞内检测到HBsAg、前S₁、前S₂、HBcAg(HBeAg)及HBxAg等。

1．肝癌及癌周肝组织内HBsAg定位及分布在肝癌组织内，HBsAg阳性率一般来说比较低，大多数报道其阳性率在10%～15%，少数报道阳性率可高达25～44%。肝癌细胞内HB－sAg阳性主要见于分化好的肝癌病例，少数亦见于中度分化及分化差的肝癌病例。一般来说，癌周肝组织内HBsAg阳性率明显高于癌组织。大多数文献报道，癌周肝组织内HBsAg阳性率为60%～80%，少数报道在90%以上。癌周肝组织内HBsAg阳性主要见于癌周肝硬变中，特别是大结节　肝硬变中。这一结果表明，HBV与肝癌的发生有密切关系。肝癌及癌周肝组织内HBsAg阳性的形态和分布状态，不同病例表现不同，就是同一病例不同部位也有很大差异。HBsAg阳性细胞分布亦不规律。绝大多数HBsAg阳性物质位于胞浆内，部分位于胞膜上，少数位于核内。HBsAg阳性物质呈细颗粒状、絮状或网状。HBsAg阳性物质在细胞内分布有三种类型：全胞浆型，阳性物质充满整个胞浆；包涵体型，阳性物质集聚成团，位于核旁一侧；胞周型或核周型，阳性物质沿着泡膜或核膜分布，呈环状。在肝癌及癌周肝组织内包涵体型或全胞浆型较多见。HBsAg阳性细胞的分布有三种类型：弥漫型，多数阳性细胞弥漫分布于切片内；局灶型，少数阳性细胞集聚于某一区域；散在型，阳性细胞较少，孤立的或零散的分布于切片内。一般来说，癌周肝组织HBsAg阳性反应强度和阳性细胞检出率比癌组织高。癌组织检出率低的原因，可能是由于癌组织不适于HBsAg的复制，或是由于HBv DNA和宿主DNA发生整合，而HBsAg不易表达所致。至于HBsAg在肝癌发病中的作用，目前尚不清楚。一般认为HBsAg作为靶抗原，通过免疫反应，造成肝细胞的损伤，肝细胞增生，不典型增生，最终可能导致癌变。

2．肝癌及癌周肝组织内前S抗原的定位及分布对肝癌及癌周肝组织内前S（pre-S₁和pre-S₂）抗原的研究远不及对HBsAg的研究。近来，国内外文献有少数报道。在肝癌组织内前S₁和前S₂抗原的检出率为20%左右，略比HBsAg检出率高。在癌周肝组织前S₁和前S₂抗原的检出率为60%左右，这个和HBsAg的检出率基本相似。在绝大多数HBsAg阳性的病例前S₁和前S₂抗原亦阳性，而在部分前S₁和前S₂阳性病例，HBsAg却呈阴性反应。因为在基因构成上，前S₁包括前S₂和HBsAg，前S₂包括HBsAg的部分，故前S₁和前S₂的表达要比HB－sAg强。用免疫组化方法染色，前S₁和前S₂阳性物质呈棕红色呈均匀细颗粒状，主要位于癌细胞及肝细胞的胞浆内，有些病例则和/或位于胞膜上及核内。阳性物质反应的强弱和前S₁或前S₂抗原的含量有关。一般来说，前S₁或前S₂阳性反应强度和阳性细胞检出率，癌周肝组织比癌组织强。这一规律和HBsAg相同。前S₁或前S₂阳性物质在细胞内的分布情况及其阳性细胞分布状态和HBsAg的基本相似。目前对前S₁或前S₂抗原在肝癌发病中的作用尚不完全清楚。有人研究证明，在人肝细胞膜上存在两种不同的受体，一种受体可以直接与前S₁蛋白结合；另一种受体通过多聚人血清白蛋白（PHSA）与前S₂蛋白结合。所以HBV通过PHSA介质结合在肝细胞上，从而形成靶抗原，通过免疫反应引起肝细胞的损伤，进而可能发生肝细胞的增生，不典型增生，最终导致癌变。

3．肝癌及癌周肝组织内HBcAg(HBeAg)的定位及分布到目前为止，在肝癌细胞内发现有HBcAg只有少数报道。所有的报道，HBcAg的检出率都不太高，大多在10%～20%左右。HBcAg和HBeAg在肝癌及癌周肝组织内不易检出或检出率较低的原因，可能是由于HBcAg 和抗HBc常以免疫复合物的形式存在于胞核内，HBcAg被封闭之故；亦可能由于HBcAg基因和宿主基因进行了整合，使HBcAg不再表达出来。HBcAg和HBeAg经常并存，因此HBeAg亦经常不易单独检出。HBcAg或HBeAg阳性物质呈均匀细颗粒状分布于胞核内，少数见于核仁内。位于核内常呈圆形或卵圆形，围绕核仁占据整个核或占据核的大部分。少数病例HBcAg阳性物质位于胞浆内或胞膜上，有的病例核、膜及浆内同时阳性。HBcAg阳性细胞的分布与HBsAg的分布相似。

关于肝癌的免疫学方面的研究，血清学方面的研究较多，组织学研究的较少。大量的流行病学和临床学方面的资料表明，肝癌患者血清中抗-HBc明显高于对照组，其阳性率高达70%～95%。用免疫组化技术在肝癌及癌旁肝组织内亦发现有抗-HBc的存在。有人证实抗-HBc为IgG，这种IgG经常和HBcAg以复合物的形式存在于细胞核内，少数也见于胞浆及胞膜上。并证实，IgG只见于含有HBcAg的胞核内，而无核内HBcAg，就无抗-HBc存在。因此，如果能测出IgG（抗-HBc），也就间接地证实了HBcAg的存在。IgG(抗-HBc)阳性呈圆形或卵圆形位于核内或以包涵体位于胞浆内。IgG阳性细胞的分布状态和HBcAg的分布相同。IgG(抗-HBc)在肝癌发病中起何作用，目前尚不清楚，有人认为IgG和HBcAg形成免疫复合的，由于免疫反应，在慢性活动性肝炎发病中和肝硬变形成中起重要作用，而慢活肝和肝硬变又是肝癌发生的重要环节　。HBcAg和抗-HBc形成的免疫复合物是否为癌变的始动因素，还有待进一步研究。

4．肝癌及癌周肝组织内HBxAg的定位及分布近年来，对HBV分子生物学研究发现了HBV另一种抗原，即HBxAg。HBxAg和肝癌发生的关系密切，已引起人们广泛的重视。目前，国内外已有少数文献报道关于HBxAg和肝癌发病的关系的研究。在人原发性肝癌组织内HBxAg的检出率大约为60%～80%，这明显高于HBsAg的检出率。在癌周肝组织内HBxAg阳性检出率在70%～80%，这和HBsAg的检出率基本相似。用PAP或ABC方法检测HBxAg，其阳性物质呈棕褐色均匀细颗粒状，主要位于癌细胞和肝细胞胞浆内，部分病例除胞浆阳性外，胞膜或核亦阳性（约20%），单独膜型或核型少见。不同病例HBxAg阳性物质的分布及阳性反应强度是不同的，就是同一病例不同部位，其结果也不尽相同。一般来说，癌周肝组织内HBxAg阳性检出率及阳性反应强度比癌组织内高。其反应强弱与HBxAg含量多少有关。HBxAg阳性细胞分布与HBsAg阳性细胞分布相似，亦分为散在型，局灶型和弥漫型。在癌周硬变组织内，HBxAg阳性细胞有时围绕小血管分布。有的则沿着纤维膈分布。在HBxAg阳性病例，有24%在癌组织内伴有HBsAg和/或HBcAg，有72%在癌周肝组织内伴有HBsAg和/或HBcAg。HBx－Ag在肝癌发病中的作用，目前尚不完全清楚。有人报道在肝癌患者血清中含有较高的抗-HBx，其检出率高达85%。Miyaki等（1986）发现在所检查的原发性肝细胞癌组织中都存在和HBV的X基因相同的DNA序列。有些作者认为，宿主细胞DNA和HBv DNA的整合是通过X基因区特殊的重组来完成的，其翻译产物-HBx蛋白（HBxAg）对癌基因具有反式激活作用，而引起细胞癌变。最近有人通过HBV的X基因在转基因小鼠中诱发肝癌的动物实验证明，HBx蛋白能够改变宿主基因的表达，并导致肝细胞癌的发生。因此，有些作者认为HBxAg在肝癌发生中具有重要作用，并认为HBV可能具有直接致癌作用。

（四）肝内胆管细胞癌及癌周肝组织内HBV抗原的分布

在原发性肝癌中，最常见的是肝细胞肝癌，而肝内胆管细胞癌比较少见，在我国大约为10%。长期以来，人们对肝内胆管细胞癌的病因及发病机理研究甚少，认识不清。早年候宝璋曾报道，胆内提管细胞癌的发生与中华分枝睾吸虫感染有关。最近有文献报道，在肝内胆管细胞癌及其癌周肝组织内检测出HBv 5中抗原（HBsAg、pre-S₁、pre-S₂、HBxAg和HBcAg），而且检出的阳性率很高。王文亮等报道（1993），在20例肝内胆管细胞癌中，HBxAg阳性检出率为75%，pre-S₁和S₂各为40%，HBsAg为10%；在19例癌周肝组织中，HBxAg阳性检出率为84%，pre-S₁和S₂各为47%，HBsAg t HbcAg分别为32%。在20例肝内胆管细胞癌的病例中有17例（85%）有不同HBV抗原的表达，其中HBxAg阳性检出率为80%。这一结果表明，肝内胆管细胞癌的发生与HBV感染有密切关系。HBV5种抗原在肝内胆管细胞癌及其癌周肝组织内的阳性反应及阳性细胞分布状态与肝细胞肝癌相同。肝内胆管细胞癌的发病过程可能与肝细胞肝癌不完全相同。肝细胞肝癌80%伴有肝硬变，特别是大结节　型肝硬变。一般认为大多数肝细胞肝癌是由于HBV感染→慢性肝炎→肝硬变→肝癌。而肝内胆管细胞癌很少伴有肝硬变，它的发生过程主要不是通过肝硬变这一重要环节　，而是由慢性肝炎，肝细胞不典型增生或中间型细胞演变为肝癌。HBV是否有直接致癌的作用尚有等进一步研究。

（五）肝细胞癌中的HBV的分子生物学

近10年来，国内外对原发性肝细胞癌中乙型肝炎病毒DNA的存在，分布及意义进行了广泛的研究，并取得了可喜的成果。用southern blot 分子杂交技术及原位分子杂交技术，在肝癌患者血清中和肝癌组织中检测HBV-DNA的分布状态。用HBV-DHA基因或其亚基因标记同位素（³²P、³⁵S等）及生物素地高辛等作为探针和肝癌及癌旁肝组织中的DNA进行杂交，通过放射自显影法检测HBV-DNA存在状态（是整合或游离）；原位分子杂交经过染色反应观察细胞内HBV-DNA的定位和分布状态。有人用southern blot方法检测肝癌病人血清中HBV-DNA的情况，只有少数病例血清中有微量的HBV-DNA，则慢性乙型肝炎患者血清却多为阳性，提示在HBsAg阳性肝癌病人血清中很少或没有可测出的HBV-DNA。目前，国内外已有不少文献报道，在肝癌组织中有整合的HBV-DNA。例如，Shafritz等（1981）检测了20例来自南非的肝癌患者，有15例HBV-DNA整合人宿主细胞DNA中，其中12例HBsAg阳性，3例HBsAg阴性而抗-HBs阳性。Tiollais（1981）检查了15例来自欧洲的肝癌标本，HBsAg或抗-HBs阳性病例，检查结果HBV-DNA均以整合形式存在。他们还观察了32例HBsAg阳性的肝癌病人，结果证明在所有肝癌组织中均有HBV-DNA。国内大多数报道在肝癌组织中HBV-DNA检出率为60%～80%。上述结果表明，人原发性肝细胞癌的发生和HBV感染有极为密切关系。

（六）肝癌发生中HBV分子遗传学及免疫机理

免疫病理学及分子生物学的研究表明，HBV不仅有间接致肝癌作用，而且还可能有直接致癌作用。HBV致癌作用的分子机理目前集中对于HBV的分子遗传学和分子免疫学的研究。在原发性肝细胞癌发生中，HBV致癌作用可能有两个模式：一是病毒的癌基因模式，就是表达病毒的癌基因（HBV-DNA）；另一个是细胞癌基因模式，在肝细胞癌变过程中，细胞癌基因可能发生启动子插入，染色体异常（缺失、重复、易位）及点突变等。研究证明，机体感染HBV后，HBV将其本身的基因掺入到肝细胞核内，和宿主细胞基因发生整合，从而使正常的肝细胞转变为癌细胞。这需要经过一个复杂的演变过程。在肝癌的HBV-DNA整合部位，常发生染色体缺失、重复或易位。Slagle等（1990）研究发现，有44%的肝细胞癌病人发生染色体的丢失，而17P的丢失常包括抑癌基因P⁵³的丢失，这可能是肝细胞癌发生的原因。Blum（1985）认为在HBV-DNA整合位点附近宿主细胞基因有重排现象。Tiollais等认为病毒DNA整合人宿主细胞DNA或与DNA发生重排，产生HBV激活的基因或激活细胞的原癌基因，进而导致细胞的转化，最终发生肝癌。有人通过实验研究证明病毒插入到细胞原癌基因附近，作为一种诱变剂，可能直接参与肝细胞癌的发生。Seifter等（1990）在体外进行X基因的转化实验，将HBV-DNA或X基因序列连在SV₄₀早期启动子的加强子上，用以转化传代鼠肝细胞及传代鼠纤维母细胞，转染成功的能稳定复制HBV的肝细胞表现出恶性生长的特征，将其接种裸鼠，显示出致癌性，并激活细胞原癌基因c-fos过量表达。这提示，HBV-DNA含有致癌基因序列，可以促进细胞向恶性转化。HBV基因组中编码加强子和X蛋白的碱基序列也有某些致癌活性。尽管如此，到目前为止，HBV致癌的分子机理尚不完全清楚，有待进一步研究。

（王文亮）