二、应用ISHH技术对染色体制片、基因分配（Chromosomalassignment of genes）的研究

（一）基本原理

染色体上基因位置分配的研究，又叫染色体图的研究，包括基因名称、基因在染色体的位置及与相邻基因的距离及其核酸序列的研究。研究基因图的方法包括家系的连锁分析法、体细胞杂交法、重组DNA技术和原位杂交法。果蝇的线形基因图和大肠杆菌、T₄噬菌体两者的环状基因图都已绘成，目前正致力于人类基因图的绘制。人类基因约有5万～10万个，根据第八次国际人类基因定位工作会议，已定位的人类基因总数达1479个。

ISHH技术对染色体基因图的研究，是用同位素或生物素、地高辛标记的核酸探针，直接同中期的染色体铺片行杂交。早期的研究是用于重复序列DNA的定位，如编码核糖体的基因18S和28S核糖体RNA定位于第13～15号染色体和第21～22号染色体短臂次缢痕区。5S核糖体RNA定位于第1号染色体上长臂的远侧Iq42～Iq43。近年已能进行单拷贝基因的定位，如胰岛素基因定位于IIp 15上、C-mos原癌基因定位于Sq22上、N-ras原癌基因定位于IPI34。在染色体11的短臂上，利用ISHH技术证明4个基因依次排列，从短臂的远端依次为胰岛素、β-球蛋白、HRASI和PTH。

（二）操作步骤（Bhatt and MCGee, 1990）

在前面已介绍了制备血培养染色体铺片的方法。下面介绍的是在染色体制片上用免疫金银染色法进行原位杂交的基因定位显示、结合Giemsa染色显带技术的操作步骤。

1．移除内源性RNA

（1）加100μl RNA酶溶液，覆以盖玻片，放在有少许2×SSC溶液的湿盒内孵育，37℃，60min。

（2）在2×SSC溶液内移除盖玻片，以2×SSC洗2×3min。

（3）等级酒精系列脱水，10%，50%，70%，90%和100%，各1min，各1min。空气干燥。

2．探针标记和纯化用缺口平移法将生物素11-dUTP标记在DNA核酸探针上。

3．变性与杂交

加20～100ng生物素标记探针到杂交液中，加入5μl 20mg/ml人或鲱鱼精子DNA，总容量为30～40μl，离心5s，混匀后，滴于染色体铺片，覆以盖玻片，盖片四周以橡皮泥封固。放入盛2×SSC溶液温盒内75℃7～8min，使之变性，继之于37℃孵育16h。

4．杂交后漂洗2×SSC溶液内移除盖玻片，将载片浸入含50%甲酰胺的2×SSC溶液内，pH7.2,20min,42℃。然后作下列程序漂洗

溶液　漂洗时间温度

2×SSc 20min42℃

1×SSC20min 室温

0.1×SSc 　20min 室温

5．免疫细胞化学显示

（1）孵育载片于PBt 15min，将片缘及背面擦干，加100μl一抗于载片（兔抗生物素抗血清1：100，以PBT稀释），孵育于37℃40～60min。

（2）快速用PBT冲洗，擦干片缘及背面，加100μl二抗抗血清（羊抗兔IgG结合10～20nm金粒，以PBT1：50稀释）于载片染色体铺片部位，37℃孵育45～60min。

（3）PBS洗3×5min。

（4）蒸馏水洗3×5min。

（5）加数滴银溶液于载片上，在光镜下监测，大约需5～18min可见在染色体上出现银斑点。

（6）蒸馏水洗。PBT配制见附录3。

6．显带复制（Replication banding）

（1）应用5μg/ml Hoechst 33258在2×SSC溶液内，暗室中染载片20min。

（2）蒸馏水洗，以2×SSC封固，覆以盖玻片，盖片四周封以橡皮泥。

（3）紫外光照射1～16h。

（4）蒸馏水洗和以10%Giemsa（磷酸缓冲液稀释，pH6.8～7.2）染色10min。

（5）蒸馏水冲洗，空气干燥，以DPX封固。

（6）光镜下观察，可见棕色的银斑点在染色体上的定位，并显示其与染色体分带的关系。