二、末端标记法

在大肠杆菌T₄噬菌体多聚核苷酸激酶（T₄PNK）的催化下，将γ-³²P-ATP上的磷酸连接到寡核苷酸的5’末端上。要求标记的寡核苷酸5’端必须带羟基。反应式为：

此法适用于标记合成的寡核苷酸探针。如将底物改为Bio –11 –dUTP，也可以在3’端标记上一个生物素。

寡核苷酸³⁵S的3’—末端标记法：将下列液体依次加入Eppendorf管中。

寡核苷酸（1 pmol）1μl

10×Tailingbuffer 2μl

[α-³⁵S]2μl

双蒸馏水14μl

末端脱氧核苷酸酶1μl（10Unit）

混合后，置于37^℃水浴中1.5h。取出反应管放入冰水中5min。加入下列液体：

TRNA(25mg/ml)3μl

1×TE(pH8.0)180μl

酚100μl

CTAa100μl

充分混合2min。离心15000r/min 5min。将上清液（约200μl）移入新的Eppendorf 管中，然后加入下列液体：

4mol/L醋酸胺100μl

100%酒精800μl

混匀，置冰浴中，15min。再15000r/min离心10min，在管底可见一白色沉淀块（含tRNA及寡核苷酸）。吸去管中液体，然后加入1000μl80%酒精，混合1～2min同上离心，吸除酒精（勿破坏沉淀块），将管置于40℃温箱中5min。加入适量的1×TE（pH8.0）及0.5mol/l DTT溶解沉淀。标记探针的最终浓度是0.5ng/μl,DTT的最终浓度为20mmol/μl。取出1μl标记探针测定比放射性，应在1.0×10dpm/μg以上。保存在-80℃中1～2个月。再次使用时应考虑到放射性同位素的衰减量。