（四）DEAE纤维素柱层析法

标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下：

DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜。常用梯度洗脱法如下：

（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗脱和收集：

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）……洗脱部分1。

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）……洗脱部分2。

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）……洗脱部分3。

将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。

（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至2.0mol/L洗脱完。

经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。