1.包埋后染色

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(1)超薄切片厚50~70nm左右,载于200~300网孔的镍网上。

(2)置1%H2O2内10min至1h(视树脂的硬度和切片的厚度而定),以去锇酸和增进树脂穿透性,有利抗体进入。如切片很薄或于低温包埋时,此步可省略。操作时,滴入1%H2O2液1滴于蜡板上,将网的载片面轻浮于液滴上。对中枢神经系统切片,有主张以1%过碘酸钾(KIO4)代替H2O2的。

(3)双蒸水洗3次,每次10min,第1,2次洗法如(2),浮于液滴上,第3次以盛双蒸水的注射器沿镍网面冲洗,水流应有适当压力,但不宜过高强,用滤纸在网缘将水吸干。

(4)浮于正常羊血清(1:50~1:100)滴上,室温30~60min,以饱和固定剂中的游离醛基占据非特异性结合部位。

(5)PBS漂洗3min,洗1次(有人主张不洗)。

(6)滤纸吸干,孵育于第一抗体血清滴上,先室温预孵1h,再置于424~36h。

(7)PBS漂洗3min,3次。

(8)PBS(内含1%的牛血清白蛋白)pH8.2中,5min,此步为胶体金结合作准备。

(9)胶体金标记抗体液1:30~1:100,淡红色为适宜稀释液,室温孵育10min至1h。

(10)双蒸水洗3min,3次。

如作双重染色,则应将镍网翻过来,用另一类抗体血清,重复上述步骤(2)~(10)。

(11)5%醋酸铀(双蒸水配制)染5min,然后用双蒸水洗。

(12)枸橼酸铀(或醋酸铅)染色5min,双蒸水洗净。

(13)电镜观察。

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