(三)酶标抗体的纯化
上述各种方法制备酶标抗体时,除产生酶标抗体外,还有未标记的抗体蛋白、游离酶、酶二聚体及偶联剂等。这些均可使酶标抗体的敏感性下降,故酶标抗体须经纯化后应用。现简介几种常用的纯化方法。
1.多聚体的分离实验中,不同的试剂形成的多聚体的数量各异,即使同样的实验药物和程序,在不同的时间制备的酶标抗体中,多聚体的数量亦不相同。多聚体较单体含酶量多,与组织的非特异吸附增强,使方法的敏感性下降,故用前必须除去多聚体。以凝胶过滤法分离多聚体的效果较好。
2.非标记抗体的分离 非标记抗体与标记抗体具有相同的免疫学特征,能竞争与组织特异抗原结合,而且亲和力较标记抗体强,优先与组织抗原结合。一般认为每个抗体连结1~2个酶分子,并不影响抗体的两个(Fab)抗原结合点,但因存在空间遮蔽现象,一个Fab段与组织特异性抗原结合。非标记抗体则不存在这种现象,两个Fab段均与抗原结合,因而亲合力较强。所以酶标抗体在应用前须用琼脂糖亲合层析等方法去除非标记抗体。
3.亲合层析 利用蛋白A(Protein A)/琼脂糖-刀豆素A/琼脂糖亲合层析柱能制得较纯的酶标抗体。因为蛋白A与抗体(标记和未标记)间有较强的亲合力,不与HRP结合。而刀豆素A与HRP(标记和游离)间的亲合力非常强,不与抗体结合。据此二者并用,能获得较纯的HRP酶标抗体。该方法省时,分离能力强(约为凝胶层析的600倍)。但有一定的局限性,因为蛋白A并非与所有种属的免疫球蛋白亲合力均较强,例:不能与羊的免疫球蛋白结合,所以难以用于纯化羊的酶标抗体。而刀豆素A与HRP的亲合力极强,甚至呈不可逆性结合,可使部分酶标抗体的活性丧失。
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