一、生物素标记核酸探针方法

生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种，如生物素-11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾标记法。实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的5位上，合成TTP或UTP的类似物。在离体条件下，这种生物素化dUTP可作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入带有缺口的DNA或RNA，得到生物素标记的核酸探针。这种标记方法称为缺口平移法。用标记在DNA上的生物素与链霉亲合素-酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记物进行检测。

缺口平移法标记生物素DNA探针：在硅化Eppendorf管（放入冰浴中）加下列反应液：

待标记DNA 0.1μg/μl 5μl

10×NTB　1μl

DNase I2pg/μl 1μl

消毒三蒸水 　3μl 总体积达10μl

混匀，37℃，15min。离心10000r/min 1min后，放入冰浴中，继续加入下列反应液：

dNTP(ACG)0.5μg/ml2μl

Bio –11–dUTP 0.5μg/ml2μl

10×NTb　4μl

消毒三蒸水　31μl

混匀，短暂离心后，加入

DNA聚合酶I（5u/μl）1μl总体积50μl

混匀，14℃过夜（10h以上），加入

终止液 2μl

经Sephadex –G –50柱分离，回收生物素标记DNA。

10×NTB配法：500mmol/l Tris –HCl, Ph7.5；100mol/L MgCl₂；80mmol/L β-巯基乙醇，500μg/ml BSA。

终止液：0.25mol/L EDTA, 10mg/ml tRNA和10mmol/l Tris –HCl (pH7.5)。

缺口平移法标记探针少量多次标记效果较好，即每次标记DNA不超过1μ.Bio –11-dUTP要浓贮，分装，-20^。C保存，反复冻融常会降解失活。Bio –11- dUTP贮存液：10mmol/L即100μg Bio-11-dUTP中加入11.6μl Bio-11 –dUTP稀释液，分装成3μl/支，-20℃保存。

地高辛-dUTP标记DNA也可按此法进行。

乙醇沉淀分离回收标记DNA比较方便，即加入5μl4mmol/l LiCl,125μl冷乙醇，混匀，-20℃放置30min,12000r/min离心5min，去上清，用70%乙醇和无水乙醇洗沉淀物，倒置离心管，晾干，用消毒三蒸水5μl溶解沉淀物（0.1μg/μl）-20^。C保存。用LiCl 可较好地分离DNA和可溶性核苷酸，因为dNTPS的锂盐在乙醇中比钠盐溶解性更大。