(二)细胞融合

《实用免疫细胞与核酸》书籍目录

1.细胞融合前准备

(1)骨髓瘤细胞系的选择:骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。

表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系

名 称来 源耐 受 药 物Ig链
H L
P3/X63-Ag8(X63)BALB/C骨髓瘤MOPC-218-氮鸟嘌呤r1  K
P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)P3/X63-Ag88-氮鸟嘌呤- -
P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)P3/X63-Ag88-氮鸟嘌呤- K(不分泌型)
P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)(X63×BALB/C脾细胞)杂交瘤8-氮鸟嘌呤- -
SP2/0-Ag14(SP2/0)(X63×BALB/C脾细胞)杂交瘤8-氮鸟嘌呤- -
F0BALB/C骨髓瘤8-氮鸟嘌呤- -
S194/5.XXO.BU.1P3/X63-Ag85-溴脱氧尿嘧啶核苷- -
MPC11-45.6TG1.7BALB/C骨髓瘤MPC-116-巯鸟嘌呤r2b  K
210.RCY3.Ag1.2.3LOU大鼠骨髓瘤R2108-氮鸟嘌呤-  K
GM15006TG-A12人骨髓瘤GM15006-巯鸟嘌呤r1  K
U-266AR人骨髓瘤U-2668-氮鸟嘌呤ελ

骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液,如RPMI1640,DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%~20%,细胞浓度以104~5×105/ml为宜,最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时,可按1:3~1:10的比例传代。每3~5天传代一次。细胞在传代过程中,部分细胞可能有返祖现象,应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理,使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

(2)饲养细胞:在组织培养中,单个或少数分散的细胞不易生长繁殖,若加入其它活细胞,则可促进这些细胞生长繁殖,所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中,许多环节 需要加饲养细胞,如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。

2.细胞融合的步骤

(1)制备饲养细胞层:一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。

与免疫小鼠相同品系的小鼠,常用BALB/C小鼠,6~10周龄

拉颈 处死,浸泡在75%酒精内,3~5min

用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜

用无菌注射器注入5~6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管)

反复冲洗,吸出冲洗液

冲洗液放入10ml离心管,1200rpm/分离5~6min

用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬,调整细胞数至1×105/ml

加入96孔板,100μl/孔

放入37。c CO2孵箱培养

(2)制备免疫脾细胞

最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死

无菌取脾脏,培养液洗 一次

脾脏研碎,过不锈钢筛网

离心,细胞用培养液洗2次

计数

取108脾淋巴细胞悬液备用

(3)制备骨髓瘤细胞

取对数生长骨髓瘤细胞离心

用无血清培养液洗2次

计数,取得×107细胞备用

(4)融合

①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起,在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次,离心,1200rpm,8min;弃上清,用吸管吸净残留液体,以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略松动。

②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG(分子量4000)溶液,边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。

③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用,每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

④离心,800rpm, 6min。

⑤充上清,用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。

⑥将上述细胞,加到已有饲养细胞层的96孔板内,每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。

⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。

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