六、杂交前处理

1．蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法：

精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20℃存放，用时再取出冻融，余者弃去。

（2）工作液（临用前配）：

取储备液（1mg/ml）按1：40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。

（3）关于P-K缓冲液的配制：

称取上述试剂，充分混合即可。

②1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)：

先将Tris于800ml ddH₂O中溶解，用HCl将pH调至8.0,ddH₂O定溶于1000ml，高压灭菌，室温备用即可。

③0.5mol/L的EDTA：

称取EDTA溶于约600ml ddH₂O中，常需60℃持续搅拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0时，EDTA才开始溶解。待完全溶解后，冷却至室温，NaOH调pH至8.0,ddH₂O定溶至1000ml，高压灭菌，室温备用。

2．甘氨酸

（1）1mol/L甘氨酸：

称取甘氨酸75g溶于ddH₂O或DEPC水中，最后补足ddH₂O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20℃储存。

（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：

将二者按1：10比例稀释，即得甘氨酸工作液。一般要求临用前新鲜配制。

甘氨酸有终止蛋白酶K作用的作用，以防过度消化。

3．0.25%醋酸-0.25%醋酸酐

配制：按上述配方，先以少许DEPC水溶解NaCl，然后加入三乙醇胺及浓HCl。DEPC水定容至约1000ml(997.5ml)，临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐，充分混合。注意操作时避免浓HCl 溅出，最好在通风条件下进行。

生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非特异吸附，降低反应背景的作用。

4．RNA酶溶液

取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分装成小份（1ml,10mg/ml），-20℃储存。

临用前，取RNA酶A储备液，用2×SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml）.

5.0.2%

取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振荡使其充分混合。