三、免疫印迹法检测ApoE表型
由于IEF法需大型设备,工作量较大,极大地限制了该法的临床应用。免疫印迹法为目前检测ApoE表型最常用方法。此法直接用血清(或血浆)作为样品,脱脂后进行IEF电泳,然后用特异性多克隆或单克隆抗体进行免疫印迹反应,根据黑色后图谱即可确定ApoE表型。此法比IEF法更省时、简便、准确。
1.仪器与试剂
电泳仪,垂直板式电泳槽,转移电泳槽,NC膜;主要试剂有:⑴3:1(V/V)乙醚脱脂液;⑵样品溶解液;0.01mol/l Tris,pH8.6,内含0.01mol/LDTT,8mol/L尿素;⑶两性电解质(Ampholine,pH4~6,LKB产品);⑷丙烯酰胺(Acr)、N-N'甲叉双丙烯酰胺(Bis),Serva产品;⑸TEMED(Sigma产品);⑹电泳缓冲液:1mol/lNaOH,1mol/L H3PO4;⑺转移电泳缓冲液:含20%甲醇,39mmol/L甘氨酸,48mmol/lTris和0.0375%SDS;⑻洗涤液(TPBS)含0.05%吐温-20,0.9%NaCl的10mmol/LPBS,pH7.4;⑼封闭液:含0.18%兔血清的TPBS或含3%BSA的TPBS;⑽羊抗人ApoE多克隆抗血清;⑾HRP标记的兔抗羊IgG:⑿4-氯-1-萘酚(Sigma产品)。
2.实验方法
(1)样品处理:抽取空腹血1~2ml,分离血清。取血清10μ置于预冷乙醇/乙醚(3:1)脱脂液中-20℃脱10h以上,离心(2500r/min)15min,弃上清后的加等量预冷的无水乙醚继续脱脂0.5h,再次离心,将沉淀样品用氮气吹干或抽真空使残余乙醚挥发;(2)IEF电泳:电泳前将样本溶解在100μl溶解液中(0.01mol/l Tris,pH8.6,内含0.01mol/LDTT,8mol/L尿素),放置37℃,1h。PAG凝胶浓度为5%,内含尿素(8mol/L),2%Ampholine,0.025%过硫酸胺(AP)及0.033%TEMED。电极液:阴极为1mol/LNaOH,阳极为1mol/LH3PO4。每份样品加样20μl,IEF条件初为300V,0.5h,然后调至700V,电泳5h。或1000V预冰30min(10℃)后,关电源,在靠阴极处放上IEF加样箔,每一空内加样后,继续电泳2h30min;(3)免疫印迹:转移电泳条件18V/cm,按转移电泳槽要求将凝胶上的蛋白电泳转移到NC膜上。5h后取出NC膜,放入封闭液内,室温过夜。用TPBS洗3次,然后用羊抗人ApoE抗血清(1:2000TPBS稀释)室温孵育6h。倾去液体,充分洗涤后,加入HRP标记的兔抗羊IgG(1:200)室温孵育2h。用PBS洗膜3次,每次10min。称取12mg4-氯-1-萘酚溶在4ml冷甲醇(-20℃)中,放入20mlPBS,加入10μ130%H2O2,放入已洗净的NC膜,缓缓摇动至蛋白带显出,蒸馏水洗后,晾干,暗处保存;(4)ApoE表型判定:根据所显示ApoE区带图谱即可确定ApoE表型,见图19-4所示。
图19-4 6种ApoE表型免疫印迹图(模式)
此方法样品用量少(10~20μl血清即可),故特别适合临床检验与大规模人群调查。由于ApoE糖类含量会影响IEF结果,所以在IEF前常用唾液酸酶预处理标本,以除去唾液酸残基。唾液酸酶的处理加强了主要区带,减弱了干扰的唾液酸型区带,克服了未用酶处理时,E3/2和E3/3有时难以分辨的困难,提高了表型判别的准确性。另外,如选用pH4~8范围的梯度作IEF电泳,则几乎能检测出至今为止所发现的所有异构体表型。国内吕新跃等应用自制E6C3株ApoE单克隆抗体作为一抗,用兔抗鼠IgG-辣根过氧化物酶标二抗,建立微量脱脂血清IEF及免疫印迹检测ApoE表型,亦取得较好效果。
- 免疫印迹法检测ApoE表型《动脉粥样硬化》
- 免疫印迹法《免疫学和免疫学检验》
- 免疫荧光或免疫酶标技术在肾脏疾病中的应用的意义《实用免疫细胞与核酸》
- 免疫抑制药物的适应症和副作用《医学免疫学》
- 免疫荧光细胞化学的原理《实用免疫细胞与核酸》
- 免疫抑制药《药理学》
- 免疫荧光细胞化学技术《实用免疫细胞与核酸》
- 免疫抑制剂《临床肝移植》
- 免疫荧光显微技术《免疫学和免疫学检验》
- 免疫抑制剂《医学免疫学》
- 免疫应答《免疫学和免疫学检验》
- 免疫抑制的维持治疗《临床肝移植》
- 免疫应答《医学免疫学》
- 免疫抑制的副作用《临床肝移植》
- 免疫应答(三):免疫耐受《医学免疫学》
- 免疫抑制《医学免疫学》
- 免疫应答(四):免疫调节《医学免疫学》
- 免疫炎症的类型《免疫学和免疫学检验》
- 免疫应答的概念《医学免疫学》
- 免疫学诊断方法《中国幽门螺杆菌研究》
- 免疫应答的过程《医学免疫学》
- 免疫学诊断《人体寄生虫学》
- 免疫应答的调节《免疫学和免疫学检验》
- 免疫学与医学《医学免疫学》
- 免疫应答过程中神经及内分泌变化《细胞和分子免疫学》
- 免疫学与生物学《医学免疫学》
- 免疫与变态反应《医学微生物学》
- 免疫学与生物技术的发展《医学免疫学》
- 免疫预防《医学微生物学》
- 免疫学与发病机理《基因诊断与性传播疾病》
- 免疫原的制备《免疫学和免疫学检验》
《动脉粥样硬化》
- 第一章 脂质化学及其代谢
- 第一节 脂质种类及化学结构(缺)
- 第二节 脂质代谢
- 第三节 脂质的生理功能
- 参考文献
- 第二章 脂蛋白的组成与结构
- 第三章 载脂蛋白的种类与结构
- 第四章 载脂蛋白基因结构及其基因型
- 第五章 脂类代谢有关酶类
- 第六章 脂蛋白受体
- 第七章 脂类代谢有关的特殊蛋白质
- 第一节 胆固醇酯转移蛋白
- 第二节 血清碱性蛋白
- 一、血清碱性蛋白质的分离及其氨基酸的组成分析
- 二、血浆碱性蛋白对细胞脂质代谢的影响
- 三.不同脂质、脂蛋白和LDL-ApoB浓度下碱性蛋白对细胞代谢的影响
- 四、酰化作用剌激蛋白与细胞的连结
- 五、碱性蛋白的信使传递途径
- 六、脂肪信号Adipsin-ASP系统
- 七、HyperApoB的病理生理
- 第三节 LDL受体相关蛋白
- 第四节 微粒体甘油三酯转移蛋白
- 第五节 胆固醇调节组件结合蛋白
- 参考文献
- 第八章 脂蛋白代谢
- 第九章 自由基与细胞凋亡
- 第十章 脂类代谢紊乱
- 第一节 高脂血症
- 第二节 高脂蛋白血症
- 第三节 遗传性载脂蛋白代谢异常
- 第四节 继发性高脂蛋白血症
- 第五节 高脂血症的监控
- 参考文献
- 第十一章 动脉粥样硬化有关细胞及生物活性因子
- 第十二章 动脉粥样硬化
- 第十三章 糖尿病高脂血症与动脉粥样硬化
- 第十四章 抑扬基因表达对脂蛋白代谢及动脉粥样硬化的影响
- 第十五章 血清脂类测定
- 第十六章 血浆脂蛋白的分离纯化及定量
- 第一节 脂蛋白分离的方法学评价
- 第二节 血浆脂蛋白超速离心分离纯化法
- 第三节 血浆脂蛋白电泳分离定量法
- 第四节 血清脂蛋白非电泳定量法
- 参考文献
- 第十七章 血清载脂蛋白分离纯化及其鉴定
- 第十八章 血清载脂蛋白的免疫测定
- 第一节 血清载脂蛋白定量的方法学及其参考值的评价
- 第二节 载脂蛋白抗体的制备
- 第三节 单向免疫扩散法
- 第四节 免疫火箭电泳法
- 第五节 免疫透行射比浊法
- 参考文献
- 第十九章 载脂蛋白表型及基因型的检测
- 第二十章 低密度脂蛋白受体的检测
- 第二十一章 动脉血管壁的生化分析
- 第一节 动脉壁的组成与结构
- 第二节 动脉血管壁细胞组分的提取
- 第三节 动脉血管壁细胞间质成分的提取
- 第四节 动脉血管壁免疫化学鉴定方法
- 参考文献
- 第二十二章 动脉粥样硬化模型及细胞培养
- 第二十三章 转基因动物在动脉粥样硬化研究中的应用
- 第二十四章 DNA的克隆与序列测定
- 附录一 参考值