三、免疫印迹法检测ApoE表型

《动脉粥样硬化》书籍目录

由于IEF法需大型设备,工作量较大,极大地限制了该法的临床应用。免疫印迹法为目前检测ApoE表型最常用方法。此法直接用血清(或血浆)作为样品,脱脂后进行IEF电泳,然后用特异性多克隆或单克隆抗体进行免疫印迹反应,根据黑色后图谱即可确定ApoE表型。此法比IEF法更省时、简便、准确。

1.仪器与试剂

电泳仪,垂直板式电泳槽,转移电泳槽,NC膜;主要试剂有:⑴3:1(V/V)乙醚脱脂液;⑵样品溶解液;0.01mol/l Tris,pH8.6,内含0.01mol/LDTT,8mol/L尿素;⑶两性电解质(Ampholine,pH4~6,LKB产品);⑷丙烯酰胺(Acr)、N-N'甲叉双丙烯酰胺(Bis),Serva产品;⑸TEMED(Sigma产品);⑹电泳缓冲液:1mol/lNaOH,1mol/L H3PO4;⑺转移电泳缓冲液:含20%甲醇,39mmol/L甘氨酸,48mmol/lTris和0.0375%SDS;⑻洗涤液(TPBS)含0.05%吐温-20,0.9%NaCl的10mmol/LPBS,pH7.4;⑼封闭液:含0.18%兔血清的TPBS或含3%BSA的TPBS;⑽羊抗人ApoE多克隆抗血清;⑾HRP标记的兔抗羊IgG:⑿4-氯-1-萘酚(Sigma产品)。

2.实验方法

(1)样品处理:抽取空腹血1~2ml,分离血清。取血清10μ置于预冷乙醇/乙醚(3:1)脱脂液中-20℃脱10h以上,离心(2500r/min)15min,弃上清后的加等量预冷的无水乙醚继续脱脂0.5h,再次离心,将沉淀样品用氮气吹干或抽真空使残余乙醚挥发;(2)IEF电泳:电泳前将样本溶解在100μl溶解液中(0.01mol/l Tris,pH8.6,内含0.01mol/LDTT,8mol/L尿素),放置37℃,1h。PAG凝胶浓度为5%,内含尿素(8mol/L),2%Ampholine,0.025%过硫酸胺(AP)及0.033%TEMED。电极液:阴极为1mol/LNaOH,阳极为1mol/LH3PO4。每份样品加样20μl,IEF条件初为300V,0.5h,然后调至700V,电泳5h。或1000V预冰30min(10℃)后,关电源,在靠阴极处放上IEF加样箔,每一空内加样后,继续电泳2h30min;(3)免疫印迹:转移电泳条件18V/cm,按转移电泳槽要求将凝胶上的蛋白电泳转移到NC膜上。5h后取出NC膜,放入封闭液内,室温过夜。用TPBS洗3次,然后用羊抗人ApoE抗血清(1:2000TPBS稀释)室温孵育6h。倾去液体,充分洗涤后,加入HRP标记的兔抗羊IgG(1:200)室温孵育2h。用PBS洗膜3次,每次10min。称取12mg4-氯-1-萘酚溶在4ml冷甲醇(-20℃)中,放入20mlPBS,加入10μ130%H2O2,放入已洗净的NC膜,缓缓摇动至蛋白带显出,蒸馏水洗后,晾干,暗处保存;(4)ApoE表型判定:根据所显示ApoE区带图谱即可确定ApoE表型,见图19-4所示。

6种ApoE表型免疫印迹图(模式)

图19-4 6种ApoE表型免疫印迹图(模式)

此方法样品用量少(10~20μl血清即可),故特别适合临床检验与大规模人群调查。由于ApoE糖类含量会影响IEF结果,所以在IEF前常用唾液酸酶预处理标本,以除去唾液酸残基。唾液酸酶的处理加强了主要区带,减弱了干扰的唾液酸型区带,克服了未用酶处理时,E3/2和E3/3有时难以分辨的困难,提高了表型判别的准确性。另外,如选用pH4~8范围的梯度作IEF电泳,则几乎能检测出至今为止所发现的所有异构体表型。国内吕新跃等应用自制E6C3株ApoE单克隆抗体作为一抗,用兔抗鼠IgG-辣根过氧化物酶标二抗,建立微量脱脂血清IEF及免疫印迹检测ApoE表型,亦取得较好效果。

1000余本中医古籍txt电子书免费下载

下载《动脉粥样硬化》 电子书打不开?

下载所有中医书籍

返回《动脉粥样硬化》书籍目录
  1. 免疫印迹法检测ApoE表型《动脉粥样硬化》
  2. 免疫印迹法《免疫学和免疫学检验》
  3. 免疫荧光或免疫酶标技术在肾脏疾病中的应用的意义《实用免疫细胞与核酸》
  4. 免疫抑制药物的适应症和副作用《医学免疫学》
  5. 免疫荧光细胞化学的原理《实用免疫细胞与核酸》
  6. 免疫抑制药《药理学》
  7. 免疫荧光细胞化学技术《实用免疫细胞与核酸》
  8. 免疫抑制剂《临床肝移植》
  9. 免疫荧光显微技术《免疫学和免疫学检验》
  10. 免疫抑制剂《医学免疫学》
  11. 免疫应答《免疫学和免疫学检验》
  12. 免疫抑制的维持治疗《临床肝移植》
  13. 免疫应答《医学免疫学》
  14. 免疫抑制的副作用《临床肝移植》
  15. 免疫应答(三):免疫耐受《医学免疫学》
  16. 免疫抑制《医学免疫学》
  17. 免疫应答(四):免疫调节《医学免疫学》
  18. 免疫炎症的类型《免疫学和免疫学检验》
  19. 免疫应答的概念《医学免疫学》
  20. 免疫学诊断方法《中国幽门螺杆菌研究》
  21. 免疫应答的过程《医学免疫学》
  22. 免疫学诊断《人体寄生虫学》
  23. 免疫应答的调节《免疫学和免疫学检验》
  24. 免疫学与医学《医学免疫学》
  25. 免疫应答过程中神经及内分泌变化《细胞和分子免疫学》
  26. 免疫学与生物学《医学免疫学》
  27. 免疫与变态反应《医学微生物学》
  28. 免疫学与生物技术的发展《医学免疫学》
  29. 免疫预防《医学微生物学》
  30. 免疫学与发病机理《基因诊断与性传播疾病》
  31. 免疫原的制备《免疫学和免疫学检验》