一、质粒或噬菌体载体与外源DNA的连接反应
外源DNA片段末端的性质,以及质粒载体和外源DNA上限制酶切位点的性质决定了质粒或噬菌体与外源DNA连接反应的不同策略。
(一)外源DNA带有非互补突出端的片段
用两种不同的限制酶分别消化质粒等载体和外源DNA,可以产生带非互补突出端的片段,这是最容易连接的片段,如图24-1所示。
将已经连接外源DNA的细菌质粒载体转化感受态的大肠杆菌,然后在含有AP等抗生素的平板上鉴定阳性重组体菌落,具体方法有:①检查α互补能力的丧失情况;②对小量制备的质粒DNA进行限制酶切的分析;③核酸杂交。
(二)外源DNA带有相同末端(平端或粘端)的片段
带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线状质粒或噬菌体载体中,在连接反应中,质粒或噬菌体载体可能发生自身环化,也可能形成串联寡聚物。因而,常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制质粒DNA的自身连接和环化。用细菌碱性磷酸酶(BAP)或牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去除线状DNA两端的5’磷酸可以最大限度地减少质粒DNA的自身环化。而具有5’末端磷酸的外源DNA片段可有效地与去磷酸化质粒DNA相连接,产生一个含有两个切口的开环分子。因为环化DNA(即使只带切口的环状DNA)的转化效率比线状DNA高得多,所以大多数转化体都含有重组质粒,如图24-2所示。
图24-2 利用磷酸酶防止载体DNA的重新环化
(三)外源DNA带有平端的片段
外源DNA片段带有平端的片段,平端的连接效率比带有互补末端的DNA要低得多。因此,涉及平端分子的连接反应所要求的T4噬菌体DNA连接酶的浓度和外源及质粒DNA或噬菌体DNA的浓度都要高得多。
(四)连接反应的体系
10×连接缓冲液1μl
10mMATp 1μl
质粒或噬菌体DNa200ng~1μg
外源DNa 200ng~1μg
T4噬菌DNA连接酶0.5~2nuits
4-6℃温育8~24h
连接反应结束时,取1~5μl上述反应混合物转化200μl的大肠杆菌感受态细胞,即可将外源DNA与载体接连起来。
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